In This Article

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتشكيل عضويات الغدة الصعترية البشرية المشتقة من iPSC التي تزرع في الهلاميات المائية الفيبرين 3D بهدف دعم نضوج الخلايا الظهارية الصعترية (TEC) والصيانة المطولة ، وكذلك تكون الغدة الصعترية في المختبر.

Abstract

إن توليد ذخيرة الخلايا التائية الوظيفية والمتسامحة ذاتيا هو عملية معقدة تعتمد على البيئة الدقيقة للغدة الصعترية ، وفي المقام الأول ، على خصائص المصفوفة خارج الخلية (ECM). تعتبر الخلايا الظهارية الصعترية (TECs) حاسمة في تكون الغدة الصعترية ، حيث تغذي وتختار الخلايا التائية النامية عن طريق تصفية المستنسخة ذاتية التفاعل. وقد ثبت تجريبيا أن TECs حساسة بشكل خاص للأدلة الفيزيائية والكيميائية التي توفرها ECM وتؤدي ثقافة الخلايا أحادية الطبقة الكلاسيكية إلى فقدان سريع للوظائف حتى وفاتها. بسبب هذه الصيانة الدقيقة جنبا إلى جنب مع الندرة النسبية ، وعلى الرغم من المخاطر العالية في نمذجة بيولوجيا الغدة الصعترية في المختبر ، لا تزال النماذج القادرة على تقليد مكانة TEC بأمانة على نطاق واسع وبمرور الوقت غير موجودة. هنا ، نصف تكوين نموذج عضوي زعتري بشري متعدد الخلايا ، حيث يتم اشتقاق حجرة TEC من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ويتم إعادة تجميعها مع أسلاف الخلايا الصعترية الأولية المبكرة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد (3D) قائم على الفيبرين. يلبي هذا النموذج الاحتياجات الحالية لنظام استزراع قابل للتطوير يعيد إنتاج البيئة الدقيقة للغدة الصعترية خارج الجسم الحي ويوضح الوظائف ، أي القدرة على إنتاج الخلايا التائية ودعم نمو الغدة الصعترية العضوية على مدى عدة أسابيع. وبالتالي ، نقترح نموذجا عمليا في المختبر لوظائف الغدة الصعترية من خلال الكائنات العضوية المشتقة من iPSC والتي من شأنها أن تفيد البحث في بيولوجيا TEC وتوليد الخلايا التائية خارج الجسم الحي.

Introduction

الغدة الصعترية هي عضو لمفاوي أساسي يلعب دورا أساسيا في توليد جهاز مناعي كفء ومتسامح1،2،3. تهاجر أسلاف الغدة الصعترية المبكرة (ETPs) من نخاع العظم إلى الغدة الصعترية ، حيث تتوسع وتتمايز إلى خلايا تائية وظيفية1،2،4،5. يتم التوسط في هذه العمليات من قبل مجموعة سكانية متخصصة ، الخلايا الظهارية الصعترية (TECs)2،6،7. تستمد TECs من السلف الظهاري الصعتري (TEPs) 8،9 وتشتمل على TECs القشرية (cTECs) و TECs النخاعية (mTECs) التي تلعب أدوارا محددة في إنشاء البيئة الدقيقة 3D المتخصصة اللازمة لهجرة الخلايا التائية وتوسيعها ونضجها. تتوسط TECs تطور الخلايا التائية بشكل أساسي من خلال توفير عوامل النمو والتمايز1،10،11 وعن طريق الاختيار السلبي للخلايا الصعترية غير الوظيفية وغير المتسامحة من خلال تقديم المستضدات الذاتية5،7،12. تلعب التفاعلات المعقدة بين الخلايا التائية النامية و TECs أيضا دورا مركزيا في النضج والتنظيم ثلاثي الأبعاد لمجموعات TEC في عملية تعرف باسم الحديث المتبادل للزعترة 1,11. تعتمد التفاعلات بين مجموعات خلايا الغدة الصعترية بعمق على البيئة المكروية المحددة التي شكلتها المصفوفة خارج الخلية (ECM). إن الغدة الصعترية ECM في حالة من المعاملة بالمثل الديناميكية مع مجموعات خلايا الغدة الصعترية ، مما يؤثر على تنظيم الجينات ويتم إعادة تشكيله باستمرار في المقابل عن طريق إفراز الإنزيمات أو بروتينات المصفوفة13. يؤثر ECM على الخلايا من خلال تعديل التوافر البيولوجي لعوامل النمو والسيتوكينات ، والإشارات المباشرة من خلال المستقبلات المرتبطة بالغشاء مثل integrins ، وتشكيل الهياكل الخلوية من خلال القوى الفيزيائية14. ثبت أن مكونات Thymic ECM ، مثل الكولاجين واللامينين ، لها تقارب كبير لعوامل النمو TGFb و FGFs ، والتي تعتبر ضرورية لصيانة TEC وإصلاحها عن طريق تشكيل المجمعات. تلعب لدونة الغدة الصعترية ECM ومعامل المرونة والكثافة أيضا دورا مهما في توجيه مصير TEC وتشكيل تجزئة الغدة الصعترية ، وهو أمر ضروري لوظائفها. تسلط هذه القرائن الضوء على أهمية مراعاة ECM وهيكلها 3D لتقليد الغدة الصعترية خارج الجسم الحي. ويدعم هذه النقطة حقيقة أن TECs الأولية تتمايز بسرعة ، وتفقد وظائفها ، وتموت في النهاية عند زراعتها في إعدادات زراعة الخلايا الكلاسيكية15،16،17.

تم تطوير نماذج الاستزراع لتوسيع مجموعات TEC الوظيفية من نباتات الغدة الصعترية البشرية من أجل الحفاظ على بنية ECM والقرائن الحاسمة التي توفرها ل TECs18،19،20. كان نظام الاستزراع هذا قادرا على التوسع بنجاح والحفاظ على مجموعة من TECs الوظيفية في المختبر ولكن لا يمكن أن يستمر بعد 7 إلى 8 أيام من الثقافة18. وبالتالي ، فإن تطوير نظام ثقافة 3D عملي يمكن الوصول إليه قادر على إعادة إنتاج البيئة الدقيقة للزعترة ووظائفها في المختبر وعلى المدى الطويل هو حصة حاسمة في هذا المجال. في الآونة الأخيرة ، أدى تطوير أنظمة ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل إلى ظهور العديد من أنظمة الغدة الصعترية الاصطناعية ، مما يشكل تقدما كبيرا لنمذجة الغدة الصعترية في المختبر 15،16،21،22. قمنا بتطوير نظام زراعة مشترك لعضوي الغدة الصعترية البشرية (hTO) من خلال إعادة تجميع ETPs الأولية البشرية مع TEPs البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) في كرويات وبذرها على هيدروجيل الفيبرين.

يهدف اختيار إعداد المواد والهيدروجيل في هذه الدراسة إلى إعادة إنتاج البنية الأصلية ل ECM الغدة الصعترية مع الحفاظ على التطبيق العملي والقدرة على توسيع نطاق العملية للحصول على مصدر مادة وفير وبأسعار معقولة للتجارب15. يظهر نظام hTO هذا إمكانية التمايز متعدد السلالات ويمكن أن يدعم تكون الغدة الصعترية المنتجة من ETPs23. يشكل هذا النظام العضوي أداة موثوقة لدراسة التفاعلات الخلوية داخل الغدة الصعترية ونمذجة تكون اللمفاويات البشرية الطبيعية والمرضية. كما أن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات يقدم قدرات تحرير الجينات في النموذج. كان التمايز الفعال ل iPSC إلى أنسجة الغدة الصعترية الوظيفية هدفا طويل الأمد للمجال على مدار ال 15 عاما الماضية ، وقد تم إحراز تقدم كبير في فك رموز مصير نسب TEC الذي يشير إلى21،24،25،26،27. للإجابة على الحاجة إلى مثل هذا النموذج الصعتري 3D في المختبر ، تصف هذه المذكرة الفنية الأساليب والتفاصيل الفنية للتوليد التدريجي لعضويات الغدة الصعترية البشرية المشتقة من iPSC ، مع التركيز على تكوين سقالة هيدروجيل ، وإعادة تجميع الكتلة الدقيقة للخلايا والبذر ، والثقافة العضوية والحصاد.

Protocol

تم إنشاء خط hiPSC hiN.Fm.m.Lon71.019 من الخلايا الليفية البالغة الذكور وإعادة برمجتها عبر نقل mRNA. تم إنشاء خط hiPSC hiN.Fm.f.Lon80.002 من الخلايا الليفية البالغة من الإناث وإعادة برمجته عبر نقل mRNA. تم إنشاء خط hiPSC hiN.Fs.f.MIPS203.003 من الخلايا الليفية البالغة من الإناث وأعيد برمجته عن طريق عدوى الناقل الفيروسي Sendai المؤتلف. تم توفير جميع خطوط الخلايا بواسطة منصة Nantes iPSC. أعطى المرضى موافقة مستنيرة على استخدام خلاياهم لأغراض البحث (مجموعة مجهولة المصدر ، Lonza ، cat # CC-2511). يتم عزل ETPs الأولية عن طريق تفكك عينات الغدة الصعترية البشرية بعد الولادة التي تم الحصول عليها كنفايات مهملة مجهولة المصدر من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب للأطفال في مستشفى نانت (CHU Nantes) في نفس اليوم ، وفقا للائحة CODECOH الفرنسية بموجب الإعلان DC-2017-2987.

1. التمايز الموجه ل iPSCs نحو هوية TEP

ملاحظة: منذ الأعمال الأولى التي نشرها لاي وجين والتي توضح تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (EScs) نحو الهوية الظهارية الصعترية28 ، طورت العديد من الدراسات بروتوكولات وحسنت تصف التمايز الموجه لخلايا iPS البشرية إلى هوية TEP21،24،25،26،27،29. تؤدي هذه الدراسات إلى تمايز TEPs التي تعبر عن علامات الهوية الظهارية الصعترية مثل FOXN1 و PAX924،25،28،30 ، بالإضافة إلى علامات الوظائف مثل DLL4 و AIRE26 ، ولكنها تفتقر إلى علامات نضج TEC24,25. وقد ثبت أن هناك نهجين لدعم نضوج TEPs المتمايزة إلى هوية TEC ناضجة: الزرع في نموذج في الجسم الحي مثل الفئران29 ، وإعادة التجميع في أنظمة عضوية الغدة الصعترية ثلاثية الأبعاد المزروعة في إعداد واجهة الهواء والسائل21. أظهر كلا النظامين الدور الحاسم الذي يلعبه الهيكل ثلاثي الأبعاد في الحفاظ على نضج مجموعات TEC الوظيفية القادرة على دعم تكون اللمفاوي T في الجسم الحي أو في المختبر 15،24،25،31.

  1. بالنسبة لنظام الغدة الصعترية العضوي المستخدم في هذه الدراسة ، قم بإجراء تمايز خلايا iPS نحو هوية TEP باتباع بروتوكول تم تطويره وتفصيله في Provin et al.23.

2. عزل ETPs الأولية من عينة الغدة الصعترية للأطفال

ملاحظة: ETPs هي أسلاف منشأ نخاع العظم تؤدي إلى سلالة الخلايا التائية والخلايا المتغصنة داخل الغدة الصعترية وتعرض النمط الظاهري التالي: CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33.

  1. تحضير حبات النضوب
    1. في اليوم السابق ، انقل حبات عزل الخلايا المغناطيسية (جدول المواد) إلى أنبوب سعة 15 مل واغسله ب 4 مل من محلول العزل (PBS + 0.1٪ BSA + 2 mM EDTA).
    2. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي ، وأزل المادة الطافية ، وأضف 2 مل من المخزن المؤقت للعزل.
    3. أضف الأجسام المضادة CD3 و CD4 و CD8 المضادة للفأر إلى الخرز واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية تحت التحريض. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي ، واغسله عدة مرات في مخزن عازل للعزل ، وأعد تعليقه في 20 مل من المخزن المؤقت للعزل.
  2. تفكك عينة الغدة الصعترية
    1. انقل عينات الغدة الصعترية الطازجة إلى طبق بتري مملوء RPMI1640 (جدول المواد). قصها بمقص تشريح معقم وكماشة إلى قطع بحجم حوالي 1 مم3 .
    2. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، اغسل الوسط والشظايا عدة مرات (يجب أن يتحول الوسط إلى غائم) ، ثم اترك الشظايا تترسب وتجمع نصف الوسط في أنبوب سعة 50 مل. أضف المزيد من الوسائط وكرر ذلك حتى يظل الوسيط صافيا.
    3. اجمع الوسط في أكبر عدد ممكن من الأنابيب سعة 50 مل حسب الضرورة ، وقم بتدوير الأنابيب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الكريات في 10 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق وإضافة 20 مل من عازلة الغسيل (PBS + 0.5٪ BSA + 4 mM EDTA + 1٪ البنسلين / الستربتومايسين).
    5. تدور في 200 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة طف. أعد تعليق الكريات في 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بتصفيتها من خلال مرشح شبكي 70 ميكرومتر ، وعد الخلايا.
  3. إثراء ETP
    1. بعد عد الخلايا ، اضبط مستوى الصوت على 10 مل لكل أنبوب باستخدام المخزن المؤقت للغسيل. أضف الكمية المطلوبة من حبات عزل الخلايا (لكل 200 مليون خلية ، استخدم 500 ميكرولتر من الخرز في 20 مل من المخزن المؤقت للعزل) واحتضانها عند 4 درجات مئوية تحت التحريك لمدة 30 دقيقة.
    2. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة ، واجمع المادة الطافية بعناية في أنبوب نظيف. قم بإزالة الأنبوب وتنظيف الخرزات ب 20 مل من العازلة العازلة. دوامة الأنبوب ، ضعه مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واجمع المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرتين.
    3. أدر المواد الطافية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الكريات في 2 مل من المخزن المؤقت للعزل وعد الخلايا.
  4. عزل ETP
    1. اضبط التركيز على 200 مليون خلية لكل مل واجمع حجما صغيرا كعنصر تحكم غير ملوث.
    2. قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة للفأر (Lin) (CD3 و CD4 و CD8 و CD14 و CD19 و CD56) و CD7 و CD34 (استخدم نفس الفلوروكروم لجميع علامات لين). احتضان على حرارة 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    3. اغسل الخلايا في حجم متساو من المخزن المؤقت للغسيل. أدر الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل ، وعد الخلايا.
    4. اضبط الحجم على تركيز 50 مليون خلية لكل مل وقم بتصفية الخلايا من خلال مرشح شبكي 70 ميكرومتر.
    5. أضف علامة الجدوى المفضلة وفرز خلايا Lin- CD34 + CD7 + الحية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام فوهة 70 ميكرومتر.

3. 3D ثقافة الغدة الصعترية العضوية

  1. إعداد TEP
    1. مباشرة بعد عزل ETP ، تحكم في جودة ثقافة TEP في الأيام 13-15. تأكد من أن الخلايا تصل إلى نقطة التقاء وتشكل طبقة أحادية كثيفة مع انتفاخات (الشكل 1).
    2. لحصاد TEPs المتمايزة ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS-/- ، وقم بإزالتها ، وأضف 1 مل من TrypLE (جدول المواد) لكل بئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
    3. أضف 1 مل من XVIVO10 (جدول المواد) لكل بئر ، واغسله عدة مرات لفصل الخلايا ، وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل ، ثم قم بتدويره بسرعة 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من XVIVO10 ، وعد الخلايا.
      ملاحظة: لتقييم فعالية التمايز في وقت مبكر ، استخدم مزرعة بشكل جيد بشكل منفصل وتحقق من التعبير عن FOXN1 و PAX9 بواسطة RT-qPCR وعائد التمايز عن طريق قياس التدفق الخلوي (محسوب على أنه جزء من خلايا EPCAM + CD205 + ، والتي يجب أن تكون أعلى من 50٪) (الشكل 1). في هذه المرحلة من التمايز ، تكون جميع خلايا EPCAM + تقريبا إيجابية أيضا ل CD205 ، مما يشهد على هويتها السابقة11.
  2. إعداد ETP
    1. مباشرة بعد عزل ETP ، قم بتدوير أنبوب التجميع عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من XVIVO10 وعد الخلايا.
  3. تجميع عضويات الغدة الصعترية
    1. ماصة الأحجام المناسبة وتجميع كل من معلقات الخلايا بتركيز 2،00،000 TEP و 40،000 ETP لكل مل ، ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة للتجانس.
    2. أضف المكملات المناسبة وفقا للجدول 1 ، ولوحة 100 ميكرولتر من معلق الخلية المختلطة لكل بئر في ألواح 96 بئر منخفضة الارتباط على شكل حرف U. استخدم ماصة متعددة القنوات لزيادة الإنتاج ؛ ومع ذلك ، فإن الماصة الكلاسيكية أحادية الطرف تحد من فقدان كميات من الخلايا الثمينة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  4. تحضير الهلاميات المائية
    ملاحظة: يوضح الشكل 2 الإعداد التجريبي المستخدم لتكوين الهيدروجيل والبذر العضوي وتوزيع وسط الاستزراع.
    1. في اليوم التالي (اليوم 1 من مرحلة الاستزراع العضوي) ، قم بإذابة حصص الثرومبين (10 وحدة / مل) ، والأبروتينين (26000 وحدة / مل) ، والفيبرينوجين (8 مجم / مل) (جدول المواد). قم بإذابة الثرومبين والأبروتينين على الثلج والفيبرينوجين في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (لا تضعه على الثلج ، لأنه سوف يترسب). لا دوامة ، ولكن ضع القسامات تحت غطاء محرك السيارة وتجانسها عن طريق ماصة لطيفة.
    2. قم بإعداد أكبر عدد ممكن من الإدخالات المعلقة حسب الحاجة لعدد الكائنات العضوية المنتجة باتباع النسب المعروضة في الجدول 2. ضع الإدخالات في آبار الاستزراع باستخدام كماشة معقمة ، واترك عمودا أو صفا واحدا على الأقل فارغا في لوحة الاستزراع.
    3. قم بإعداد العديد من الأنابيب سعة 1.5 مل مثل المواد الهلامية المراد صبها. في كل أنبوب ، ماصة أولا الكميات المطلوبة من الفيبرينوجين والأبروتينين كما هو مفصل في الجدول 2.
    4. في المرة الثانية ، أضف حجم Thrombin المطلوب في أنبوب واحد ، واغسله بسرعة 2 مرات دون إنشاء فقاعات لتجانس الكواشف ، ثم ارسم محتوى الأنبوب بالكامل واغسل المزيج بسرعة في الملحق المعلق. ضع الماصة عموديا فوق مركز الملحق ، واغسل مزيج الكاشف برفق دون توليد فقاعات.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، تعد سرعة التنفيذ أمرا بالغ الأهمية حيث ستتبلمر الكواشف في بضع ثوان ، ومن المهم مزجها بشكل صحيح لتجنب تكوين كتل أو كثافة غير متساوية في الجل. تابع بئرا واحدا في كل مرة باستخدام أنبوب مختلف سعة 1.5 مل لكل بئر (إذا تم إعادة استخدام أنبوب لعدة آبار ، فقد تسد كتل الهلام الصلبة المتبقية طرف الماصة). إذا حدثت البلمرة بسرعة كبيرة بسبب النشاط العالي للثرومبين ، فاستخدم تخفيفا بنسبة 1: 2. بعد الصب مباشرة ، يجب أن تكون المواد الهلامية شفافة إلى شفافة قليلا ولا تزال تتدفق بعد بضع ثوان عندما تميل اللوحة عموديا.
    5. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية حتى يصلب المحلول الشفاف ويتحول إلى اللون الأبيض غير الشفاف ، وتبقى المواد الهلامية ثابتة في مكانها عند إمالة اللوحة عموديا (الشكل 2 أ).
  5. البذر العضوي
    1. تحقق من جودة خطوة التجميع. تأكد من أن الكتل الدقيقة تشكل كتل خلايا كروية ، مع نواة مدمجة محاطة بهالة منخفضة الكثافة من ETPs (الشكل 3).
    2. اقطع طرف مخروط P200 واغسله بمحلول مضاد للالتصاق (جدول المواد). لحصاد كتل الخلايا ، قم بإمالة اللوحة إلى وضع عمودي تقريبا: ستغرق الكتل الدقيقة في الجدار السفلي للآبار ويمكن استردادها بسهولة عن طريق دفع طرف الماصة تدريجيا إلى قاع البئر أثناء الشفط.
    3. بذر الكتلة في الجزء العلوي من الهلاميات المائية عن طريق إيداعها بدقة دون لمس الجل بطرف الماصة ، باتباع النسب الواردة في الجدول 1 (الشكل 2 ب). حتى لو بدت المواد العضوية عائمة بحرية في هذه المرحلة ، فعندما تنتفخ بوسط الاستزراع ، سوف يلين الجل ، وستعشش المواد العضوية في الطبقة العليا. تحقق تحت المجهر من عدم ترك أي عضوي في آبار P96.
    4. قم بإعداد الحجم المطلوب من وسط الاستزراع وفقا للجدول 1 والجدول 2 ، وفي كل بئر ، أضف ببطء ربع الحجم في الجزء العلوي من الهلاميات المائية دون لمسها عن طريق السحب على طول جدران الإدخال والثلاثة أرباع المتبقية في قاع البئر عن طريق وضع الماصة بين أذرع الملحق المعلق (الشكل 2C).
    5. ضع 1 مل من برنامج تلفزيوني في آبار الاستزراع الفارغة للحفاظ على الرطوبة في اللوحة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2.
  6. ثقافة الغدة الصعترية العضوية
    1. في اليوم 2 ، تحقق مما إذا كانت المواد العضوية مصنفة جيدا: يجب أن تظل الهلاميات المائية في مكانها ، ويجب ألا تكون الكائنات العضوية قد ترسبت في قاع الإدخال.
    2. إعداد الكمية المطلوبة من وسط الاستزراع وفقا للجدول 1 والجدول 2. قم بإزالة الوسط عن طريق توجيه طرف مخروط الشفط بين أذرع الملحق المعلق ، مع التأكد من عدم لمس الجل. أضف الوسيط الجديد عن طريق وضع الماصة بنفس الطريقة.
    3. تغيير الوسط كل يومين ، والتحول إلى وسيط المرحلة الثانية (الجدول 1) بعد 2 إلى 4 أيام (في اليوم 18 بعد بدء تمايز TEP).
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على الدفعة العضوية في الثقافة بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
  7. حصاد العضوية
    1. تحضير أنبوب 15 مل مع 1 مل من TrypLE لكل بئر للحصاد.
    2. اقطع طرف مخروط P1000 وقم بتغطيته بمحلول مضاد للالتصاق. ماصة الجل برفق عن طريق وضع طرف الماصة عموديا في وسط الحشوات (احرص على عدم ثقب الغشاء) ونقله إلى أنبوب TrypLE. اغسل غشاء الإدخال باستخدام TrypLE وانقله إلى الأنبوب أيضا.
    3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، دوامة بلطف على فترات 5 دقائق. تأكد من أن المواد الهلامية والمواد العضوية تنفصل.
    4. بعد 15 دقيقة ، صفيه على مرشح شبكي 70 ميكرومتر وقم بتدويره عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للغسيل وانتقل إلى الطريقة التحليلية المفضلة.

النتائج

يتم تلخيص سير عمل البروتوكول في الشكل 4. بالنسبة لنموذج الثقافة العضوية ثلاثي الأبعاد هذا ، اعتمدنا هيدروجيل الثرومبين والفيبرينوجين الذي استخدمه فريقنا سابقا للحفاظ على mTECs الأولية للفأر لبضعة أيام ، وذلك بفضل الإشارات الفيزيائية والميكانيكية التي قدمها34. بعد البلمرة ، يجب أن يعرض الجل بنية شبكية فضفاضة تشبه الإسفنج (الشكل 5).

بعد مرحلة البذر والتعلق الأولية ، نمت الكائنات العضوية تدريجيا وتطورت على السطح وداخل الطبقات العليا من الهلام. اعتمادا على خصائص الهلام ، وظروف البذر ، وعدد المواد العضوية المصنفة على الجل ، شكلت الكائنات العضوية هياكل كروية إلى مستطيلة (الشكل 6) واندمجت أحيانا لتشكيل هياكل أكبر. لوحظ مستويان فرعيان معينان من التنظيم داخل الكائنات العضوية بعد الأسبوع الأول من الثقافة: أولا ، لاحظنا هياكل طويلة تشبه إسقاط سطح الخلية تتكون من خلايا كبيرة تشع من الكائنات العضوية وتستعمر الهيدروجيل في جميع الاتجاهات (الشكل 6 والشكل 7). ثانيا ، لاحظنا هياكل شبيهة بالعنقودية تشكلها خلايا أصغر تركز حول نتوءات الخلايا هذه. على الرغم من أننا لم نتمكن من عزل كلا النوعين من الخلايا لتأكيد فرضية الدراسة ، إلا أن هذه الظاهرة تذكرنا بترتيبات 3D الموجودة داخل قشرة الغدة الصعترية ، والتي تشكلت من تفاعل cTECs الفردية مع عدد كبير من الخلايا التائية النامية الأصغر بكثير ، والمعروفة باسم مجمعات الخلايا الممرضة الصعترية11 (الشكل 8).

في عدة نقاط زمنية خلال مرحلة الاستزراع العضوي ، قمنا بتقييم التركيب الخلوي لعضويات الغدة الصعترية عن طريق قياس التدفق الخلوي وحددنا العديد من المقصورات الرئيسية: TEC (تتميز باسم EPCAM + CD45-) ، والخلايا الصعترية (EPCAM- CD45 + CD3 +) (الشكل 9) ، بالإضافة إلى حجرة EPCAM- CD45 + CD3- التي تضم مجموعات فرعية من الخلايا الصعترية المكونة للدم غير الغدة الصعترية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في Provin et al.23.

figure-results-2124
الشكل 1: توصيف تمايز iPSC إلى TEP. (أ) مثال على تمايز iPSC إلى TEP عند D13 ، مجهر تباين الطور المقلوب ، 400x. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. (B) مثال على الرسم النقطي ، نسبة خلايا EPCAM + بين خلايا DAPI في اليوم 14 من التمايز ، صورة من FlowJo 10.0.7. (ج) التلوين المناعي ضد DAPI (الأزرق) ، PAX9 (الأحمر) ، و KRT8 (الأخضر) ، والتألق المناعي ، والتصوير متحد البؤر في اليوم 16 من تمايز iPSC إلى TEP. تشير الأسهم البيضاء إلى أمثلة على تلطيخ مضاد ل PAX9. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (D) مستوى التعبير ل FOXN1 (RQ إلى GAPDH) أثناء تمايز iPS إلى TEP. TEC: مرجع التحكم الإيجابي ، TECs البشرية الأولية المعزولة من عينات الغدة الصعترية للأطفال. الرسم البياني من المنشور (GraphPad الإصدار 8.0.1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3214
الشكل 2: الإعداد التجريبي لتكوين الهيدروجيل ، والبذر العضوي ، وتوزيع وسط الاستزراع. (أ) صفيحة استزراع بها هلاميات مائية مصبوبة في حشوات معلقة موضوعة في الصفين العلوي والسفلي. (ب) البذر العضوي: يتم وضع مخروط الماصة المقطوع الذي يحتوي على 1 عضوي فوق الهيدروجيل دون لمسه ، ويتم زرع العضو العضوي برفق على سطح الجل. (ج) يتم ترسيب وسط الاستزراع في بئر الاستزراع عن طريق وضع طرف الماصة بين أذرع الملحق المعلق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4009
الشكل 3: D0 من مزرعة الغدة الصعترية العضوية قبل البذر (الأيام 13-15 من البروتوكول الكامل). (أ) عضوي منتج باستخدام TECs مشتق من خط Lon71.019 iPS. (B) عضوي ينتج باستخدام TECs المشتقة من خط iPS MIPS203.003. مجهر تباين الطور المقلوب ، 1000x. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4651
الشكل 4: تمثيل موجز لجميع خطوات البروتوكول. تم جمع عينات الغدة الصعترية للأطفال وفصلها ، وتم فرز Lin- CD34 + CD7 + ETPs الأولية حسب قياس التدفق الخلوي. تم إجراء تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات نحو هوية TEP. تم تجميع ETPs و TEPs المشتقة من iPS وبذرها في ألواح منخفضة الارتباط من 96 بئرا وتجميعها في عضويات الغدة الصعترية بين عشية وضحاها. تم تحضير الهلاميات المائية الفيبرينية من الأبروتينين والفيبرينوجين والثرومبين وصبها في حشوات معلقة. بعد البلمرة ، تم زرع المواد العضوية فوق الهلاميات المائية ، وأضيف وسط استزراع المرحلة 1 إلى الآبار. تم الاحتفاظ بالمواد العضوية في الثقافة لمدة تصل إلى 6 أسابيع. تم إنشاؤه في BioRender ، AG26EFCZOM ترخيص النشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5654
الشكل 5: تنظيم وهيكل الهيدروجيل. مجهر تباين الطور المقلوب ، 1000x. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6090
الشكل 6: عضويات ناضجة وتركيب ثلاثي الأبعاد. (أ) الغدة الصعترية العضوية في اليوم 24 من الثقافة ثلاثية الأبعاد ، خط MIPS203.003 iPS. (B) صورة مركبة لعضوي الغدة الصعترية في اليوم 32 من الثقافة ثلاثية الأبعاد ، خط Lon71.019 iPS. مجهر تباين الطور المقلوب. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6745
الشكل 7: تفاصيل تركيب عضويات الغدة الصعترية. (أ) عضوي الغدة الصعترية في اليوم 32 من الثقافة ثلاثية الأبعاد ، خط L71.019 iPS. (ب) عضوي الغدة الصعترية في اليوم 27 من ثقافة 3D ، خط L80.002 iPS. مجهر تباين الطور المقلوب ، 400x. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7373
الشكل 8: تفاصيل بنية عضو الغدة الصعترية في اليوم 32 من ثقافة 3D. تشير الأسهم البيضاء إلى مجموعات من الخلايا الصعترية الصغيرة التي تتكاثر على مقربة من خلايا TEC. مجهر تباين الطور المقلوب ، 400x. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7936
الشكل 9: نسبة حجرة الخلايا التائية داخل عضويات الغدة الصعترية. (أ) مثال على مخطط نقطي ، نسبة خلايا CD45 + CD3 + داخل الخلايا الحية (DAPI-) في عضويات الغدة الصعترية في اليوم 35 من الثقافة ثلاثية الأبعاد ، صورة من FlowJo 10.0.7. يتكون جزء CD45 + CD3- من خلايا غير توتية مكونة للدم. (ب) نسبة خلايا CD45 + CD3 + داخل الخلايا الحية في عضويات الغدة الصعترية في الأيام 17 و 24/25 و 32 و 39/40 من الثقافة ثلاثية الأبعاد ، n = 2 في الرسم البياني الفني المكرر أو الثلاثي ، من المنشور (GraphPad الإصدار 8.0.1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وحدةالمرحلة 1 متوسطة اليوم 14 حتى اليوم 18المرحلة 2 متوسطة اليوم 19 فصاعدا
قاعدةXVIVO10XVIVO10
بي إم بي 4نانوغرام/مل50
إف جي إف 8نانوغرام/مل10
إف جي إف 10نانوغرام/مل10
منتدى حوكمة الإنترنت 1نانوغرام/مل10
إي جي إفنانوغرام/مل10
الرتبة Lنانوغرام/مل5050
IL7نانوغرام/مل55
FLT3 Lنانوغرام/مل55
إس سي إفنانوغرام/مل1010
جلوتاماكسنانوغرام/مل1%1%

الجدول 1: المكملات الغذائية وتركيزات كل منها.

أبروتينين (ميكرولتر)الثرومبين (ميكرولتر)الفيبرينوجين (ميكرولتر)المرحلة 1 المتوسطةعضويات (وحدة)
24 لوحة بئر5757513 إلى 5
12 لوحة بئر9.2138.2138.21.85
6 لوحة بئر16240.8240.83.28 إلى 9

الجدول 2: النسب المطلوبة لمكونات تحضير الهلاميات المائية وعضويات البذر في ألواح 6 و 12 و 24 بئرا.

Discussion

بالمقارنة مع الثقافة أحادية الطبقة الكلاسيكية في 2D أو حتى نماذج 3D الأكثر تقدما مثل RTOC (ثقافة أعضاء الغدة الصعترية المعاد تجميعها) ، فإن النموذج الذي وصفناه هنا يقدم تحسينات كبيرة. من وجهة نظر تقنية، يوفر هذا النموذج قابلية محسنة للتوسع والتكرار حيث يتم اشتقاق TECs من خلايا iPS ذاتية التجديد. كما يسمح بتحرير الجينات في مرحلة iPSC لتسهيل إجراء الدراسات أو ضربها في TECs. إن بقاء عضويات الغدة الصعترية الموضحة في هذه الدراسة أمر رائع ويوفر تحسنا كبيرا نسبيا لثقافات 2D أو RTOC ، مع توليد الخلايا التائية خلال فترة تصل إلى 6 أسابيع (الشكل 9). وبالتالي ، فإن إعادة تكوين بنية الغدة الصعترية ثلاثية الأبعاد وخصائص ECM تؤدي إلى وظائف الغدة الصعترية المستدامة في عضويات الغدة الصعترية لدينا ، أي القدرة على توليد الخلايا التائية من حجرة الخلايا الصعترية الأكثر نضجا ، والمهاجرين الجدد للغدة الصعترية في حوالي الأسبوع 4 من ثقافة 3D ، مع توليد كل من خلايا CD4 + و CD8 + T23.

نظرا لأن البيئة الدقيقة للغدة الصعترية تدعم نشاط التمدد والتمايز المكثف ، فإن التبادل الغازي المناسب هو معلمة حاسمة في أي نموذج للغدة الصعترية في المختبر. في الواقع ، لوحظت نتائج محسنة في النماذج التي تم الحفاظ عليها إما في جو ثنائي الأكسجين المخصب أو في واجهات الهواء السائل21,35. تدعم ملاحظاتنا هذه النقطة وتسلط الضوء على أهمية البذر العضوي الصحيح في الجزء العلوي من الهيدروجيل أسفل واجهة الهواء مباشرة. العيوب في البلمرة التي تؤدي إلى الهلاميات المائية اللزجة إلى السائلة سوف تتسبب في غرق المواد العضوية في الجزء السفلي من الإدخالات وتعيق نموها. تعد الزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية على الرقاقة بديلا واعدا يمكن أن يكسر هذا الحاجز عن طريق إضافة الأوعية الدموية. يقتصر حجم عضويات الغدة الصعترية المنتجة في هذه الدراسة على حوالي 5 مم ، ويرجع ذلك إلى نقص تبادل الغازات والمغذيات في المناطق الأساسية. وبالتالي فإن الأوعية الدموية ستسمح بتوسيع نطاق المزرعة ، جنبا إلى جنب مع تحسين العملية ، تسمح بإنتاج المواد العضوية التي تحتوي على ملايين الخلايا TECs والخلايا التائية. تعد كثافة الهيدروجيل أيضا معلمة حاسمة ، كما أن استنساخها عبر الدفعات هو أحد القيود الرئيسية للبروتوكول ، نظرا لحساسية الإنزيمات لدورات التجميد والذوبان. خطوة صب هيدروجيل هي خطوة حاسمة في البروتوكول ؛ نوصي بإجراء اختبار عن طريق صب هيدروجيل واحد 1 ساعة قبل أي تجربة مخططة للتحقق من نشاط الكاشف. في حالة عدم كفاية النشاط الأنزيمي الذي يؤدي إلى ضعف البلمرة وبالنظر إلى تكلفة TEPs المشتقة من iPSC ، فإننا لا ننصح بأي استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوى بدء البروتوكول مرة أخرى باستخدام حصص الكواشف الطازجة. تعتبر TECs منتجين مهمين لإدارة المحتوى في المؤسسة. ومع ذلك ، نظرا للتطورات الحديثة في فهم دور الخلايا الليفية الصعترية ، قد يكون من المثير للاهتمام إضافة مجموعة من الخلايا الليفية المشععة إلى النموذج العضوي. يمكن أن تفرز هذه المجموعة عوامل النمو و ECM التي من شأنها أن تشارك في إعادة إنتاج بيئة الغدة الصعترية مع تأثيرات إيجابية على تمايز الخلايا TEC و T وصيانتها. من القيود المهمة الأخرى لهذا النموذج العضوي للغدة الصعترية عدم وجود فصل مناسب للنخاع القشري. نظرا لأن الخلايا الليفية المحفظية للغدة الصعترية قد ثبت أنها تشكل تكوين القشرة ، فإن إضافتها إلى نموذج الثقافة يمكن أن تساعد في معالجة هذا القيد. وبالتالي ، يقدم هذا البروتوكول أساس النماذج المعقدة في المختبر من الغدة الصعترية. فهو يجمع بين التطورات الحديثة التي تحققت في مجالات التمايز الصعترية iPSC ، والثقافات القائمة على هيدروجيل 3D ، وتكون اللمفاوي في المختبر. يمكن تحسين هذا النموذج بشكل أكبر لمعالجة قابلية التوسع وزيادة تعقيده ، على سبيل المثال ، عن طريق إضافة مقصورات اللحمة المتوسطة والأوعية الدموية. وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى منصات بحثية قيمة حول المناعة أو التطبيقات في العلاج بالخلايا التائية الشخصية.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر أعضاء المرفق الأساسي iPSC في نانت ، فرنسا ، برئاسة لوران ديفيد. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج JP-Rare Disease JTC2019 مشروع TARID (EJPRD19-208) بتمويل من ANR (ANR-19-RAR40011-5) إلى M.G. من خلال منحة RFI Bioregate (ThymIPS) من la Région Pays de la Loire إلى M.G. ، من قبل ANR (ANR-22-CE15-0045) إلى M.G. ومشروع "SATT Ouest Valorisation" OrgaTreg to M.G. N.P. تم دعمه من قبل "la fondation d'entreprise ProGreffe". وحظيت م. د. أ. بدعم من "مؤسسة البحوث الطبية". نشكر المرفق الأساسي ل iPSC في نانت ، بدعم من IBiSA و Biogenouest ، على استخدام مواردهم ودعمهم الفني. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل برنامج Labex IGO المدعوم من الوكالة الوطنية للبحوث من خلال استثمار البرنامج المستقبلي ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AprotininSigma Aldrich616370
BMP4Miltenyi130-111-165
CCR7 (CD197)BD BiosciencesPEClone: 3D12; Dilution: 1: 200
CD14BD BiosciencesFITCClone: M5E2; Dilution: 1: 200
CD19BD BiosciencesPEClone: HIB19; Dilution: 1: 200
CD205BioLegendFITCClone: MG38; Dilution: 1: 200
CD3BD BiosciencesPEClone: HIT3a; Dilution: 1: 200
CD34BD BiosciencesFITCClone: 8G12; Dilution: 1: 100
CD4BD BiosciencesPEClone: RPA-T4; Dilution: 1: 100
CD4BD BiosciencesBV711Clone: L200; Dilution: 1: 200
CD45BD BiosciencesPerCPClone: HI30; Dilution: 1: 200
CD56BD BiosciencesPEClone: B159; Dilution: 1: 200
CD62LBD BiosciencesBV605Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200
CD69BD BiosciencesBV510Clone: FN50; Dilution: 1: 200
CD7BD BiosciencesAPCClone: M-T701; Dilution: 1: 200
CD8BD BiosciencesPeCy7Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200
CD8BD BiosciencesPEClone: HIT8a; Dilution: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgGInvitrogen11041
EGFMiltenyi130-097-751
EPCAM (CD326)BD BiosciencesPEClone: HEA-125; Dilution: 1: 200
EPCAM (CD326)MiltenyiBV711Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200
FGF10Miltenyi130-127-858
FGF8Biotechne R&D423-F8
FibrinogenSigma Aldrich341578
FLT3 LPeprotechAF-300-19
GlutamaxGibco35050-61
IGF1Miltenyi130-093-886
IL7PeprotechAF-200-07
RANK LBiotechne R&D6449-TEC
Red blood cell lysis solutionMiltenyi130-094-183
RPMI1640Gibco11875093
SCFPeprotechAF-300-07
ThrombinSigma Aldrich605190
TrypLEGibco2605010
XVIVO10LonzaLONBE04-380Q

References

  1. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  2. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).
  3. Miller, J. F. A. P. The function of the thymus and its impact on modern medicine. Science. 369 (6503), (2020).
  4. Haddad, R., et al. Dynamics of thymus-colonizing cells during human development. Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).
  5. Cumano, A., et al. New molecular insights into immune cell development. Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).
  6. Bautista, J. L., et al. Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla. Nat Commun. 12 (1), 1096 (2021).
  7. Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC. Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).
  8. Alves, N. L., et al. Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments. Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).
  9. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  10. Tavian, M., Peault, B. Embryonic development of the human hematopoietic system. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).
  11. Abramson, J., Anderson, G. Thymic epithelial cells. Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).
  12. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  13. Sharma, H., Moroni, L. Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation. Adv Sci. 8 (14), 2100543 (2021).
  14. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci STKE. 2002 (119), 6 (2002).
  15. Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -. J., Boukamp, P., Kyewski, B. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).
  16. Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation. Biomaterials. 118, 1-15 (2017).
  17. Asnaghi, M. A., et al. Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells. Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747 (2021).
  18. Villegas, J. A., et al. Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality. Front Immunol. 9, 1663 (2018).
  19. Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla. Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).
  20. Campinoti, S., et al. Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds. Nat Commun. 11 (1), 6372 (2020).
  21. Ramos, S. A., et al. Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).
  22. Fan, Y., et al. Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts. Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).
  23. Provin, N., et al. Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development. bioRxiv. 2023, 572664 (2023).
  24. Parent, A. V., et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).
  25. Sun, X., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).
  26. Inami, Y., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype. Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).
  27. Gras-Pena, R., et al. Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus. J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).
  28. Lai, L., Jin, J. Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).
  29. Ramos, S. A., et al. Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).
  30. Provin, N., Giraud, M. Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED. Front Immunol. 13, 930963 (2022).
  31. Montel-Hagen, A., et al. In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells. Cell Rep. 33 (4), 108320 (2020).
  32. Park, J. -. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation. Science. 367 (6480), 3224 (2020).
  33. Flippe, L., et al. Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 577464 (2020).
  34. Padonou, F., et al. Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium. EMBO Rep. 23 (3), e53576 (2022).
  35. Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis. Front Immunol. 12, 652665 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved