In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إنشاء عضويات الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) من خلايا ظهارة سطح المبيض البشري الأولية (hOSE). يتضمن البروتوكول عزل hOSE من المبايض التي تم جمعها حديثا ، والتوسع الخلوي ل hOSE ، وإجراءات الحفظ والذوبان بالتبريد ، والاشتقاق العضوي. يتم تضمين التألق المناعي والتحليل الكمي وعرض المنفعة كمنصة فحص.

Abstract

تتعرض ظهارة سطح المبيض (OSE) ، وهي الطبقة الخارجية من المبيض ، للتمزق أثناء كل إباضة وتلعب دورا مهما في التئام جروح المبيض مع استعادة سلامة المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون OSE بمثابة مصدر لسرطانات المبيض الظهارية. على الرغم من أن الخصائص التجديدية ل OSE قد تمت دراستها جيدا في الفئران ، إلا أن فهم الآلية الدقيقة لإصلاح الأنسجة في المبيض البشري لا يزال يعوقه الوصول المحدود إلى المبايض البشرية ومناسب في بروتوكولات الزراعة في المختبر . توفر الكائنات العضوية الخاصة بالأنسجة ، وهي نماذج مصغرة في المختبر تكرر الجوانب الهيكلية والوظيفية للعضو الأصلي ، فرصا جديدة لدراسة فسيولوجيا الأعضاء ونمذجة الأمراض واختبار الأدوية.

هنا ، نصف طريقة لعزل OSE البشري الأولي (hOSE) من المبايض الكاملة وإنشاء عضويات hOSE. قمنا بتضمين توصيف مورفولوجي وخلوي يظهر عدم التجانس بين المتبرعين. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر قدرة طريقة الثقافة هذه على تقييم التأثيرات الهرمونية على نمو OSE-organoid على مدى فترة 2 أسبوع. قد تمكن هذه الطريقة من اكتشاف العوامل التي تساهم في تجديد OSE وتسهيل فحوصات الأدوية الخاصة بالمريض بحثا عن OSE الخبيث.

Introduction

يعتبر المبيض أحد أكثر الأعضاء ديناميكية في الجسم ، حيث يخضع لدورات ثابتة من التئام الجروح وإعادة تشكيلها طوال العمر الإنجابي للفرد. اللاعب الرئيسي الذي يشارك في تجديد أنسجة المبيض بعد كل دورة إباضة هو ظهارة سطح المبيض (OSE)1. OSE عبارة عن طبقة مفردة مشتقة من الظهارة المتوسطة تحتوي على خلايا ظهارية مسطحة ومكعبة وعمودية تغطي سطح المبيض بالكامل2. قبل الإباضة ، يخضع النسيج اللحمي المبيضي على سطح جريب التبويض لاضطراب بروتيني للسماح بإطلاق مجمع البويضات الركامية. ثم يتم إصلاح المنطقة المصابة ، والمعروفة باسم وصمة التبويض ، مع الإغلاق الكامل لسطح المبيض في أقل من 72 ساعة في الفئران3. إن القدرة عالية الكفاءة ل OSE على التكاثر وإغلاق جرح التبويض تسلط الضوء على الوجود المفترض لمجموعة الخلايا الجذعية المقيمة4. نظرا لمحدودية توافر المبايض البشرية من المتبرعين في سن الإنجاب ، فإن معظم المعرفة حول آليات إصلاح OSE تأتي من النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، فإن السمات الخاصة بالأنواع تعيق الترجمة من أبحاث المبيض القائمة على إلى البشر5.

استخدمت الدراسات في المختبر في الغالب ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ل OSE البشري ، حيث نمت الخلايا في طبقة أحادية متصلة بسطح لوحة الثقافة ، نظرا لفعاليتها من حيث التكلفة وسهولة ثقافتها6،7،8. ومع ذلك ، فإن هذا النهج له قيود تكرر تعقيد ديناميكيات أنسجة المبيض9. في هذا الصدد ، أحدثت منصات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مع التركيز بشكل خاص على عضويات المبيض ثورة في أبحاث المبيض10. يتم تصغير عضويات الأنسجة في تمثيلات مخبرية للعضو الذي تستمد منه ، وتظهر قدرة التنظيم الذاتي 3D وتحاكي الوظائف والهياكل الرئيسية لنظيراتها في الجسم الحي 11. توفر هذه التقنية إمكانية إلقاء الضوء على الأسئلة الأساسية المتعلقة بالتطوير والتجديد وإصلاح الأنسجة في المبيض البشري10. في السنوات الأخيرة ، طبق الباحثون أيضا المعرفة على عضويات المبيض لتوليد عضويات سرطان المبيض الخاصة بالمريض (OC) لنمذجة الأمراض والطب الشخصي12،13،14.

استنادا إلى الطرق المختلفة المستخدمة لتوليد عضويات OSE للفأر وعضويات قناة فالوب (FT)15,16 بالإضافة إلى عضويات OSE البشرية12 وعضويات FT17 ، نصف هنا بروتوكولا لاشتقاق عضويات OSE البشرية من المبايض البشرية مع التطبيقات المحتملة في دراسات تجديد OSE. يعزل هذا البروتوكول بكفاءة خلايا OSE الأولية عن المبايض البشرية الكاملة ويتضمن وصفا خطوة بخطوة لتوسيع خلايا 2D وتوليد 3D hOSE العضوي. أظهرت عضويات hOSE تباينا (خاصا بالمانحين) في التشكل والنمو ، مما يسلط الضوء على فائدتها للدراسات الشخصية. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن هذا البروتوكول صيانة hOSE العضوية ، والمرور ، والتألق المناعي داخل نفس لوحة الاستزراع. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر وصفا للمورفولوجيا المختلفة التي يمكن أن تتبناها عضويات hOSE ويميز التغيرات في النمط المناعي أثناء الثقافة. أخيرا ، يعرض فائدة من خلال التحقيق في تأثير الإشارات البيئية ، مثل هرمونات المبيض ، على تكوين ونمو الأعضاء hOSE بناء على عدد وحجم العضو hOSE.

سيعزز تطبيق تقنية hOSE العضوية فهمنا للمبيض ، مع التركيز بشكل خاص على الآليات المسؤولة عن قدرته التجددية الرائعة. مع استمرار تطور نماذج المبيض البشري 3D ، سينخفض الاعتماد على النماذج الحيوانية في أبحاث المبيض ، مما يؤدي إلى علاجات مبتكرة في مجال الطب التجديدي18.

Protocol

وقد أجريت الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي. تم تقديم تصميم الدراسة إلى لجنة الأخلاقيات الطبية التابعة للمركز الطبي بجامعة ليدن (LUMC) ، وتم الحصول على خطاب عدم اعتراض (B18.029) قبل الدراسة. تم جمع أنسجة المبيض البشرية الأولية المستخدمة من الأشخاص المتحولين جنسيا الذين يخضعون لجراحة تأكيد الجنس في مستشفى VUmc (أمستردام ، هولندا). وتم الحصول على موافقة مستنيرة موقعة من جميع الجهات المانحة. يتم سرد جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. عزل خلايا OSE الأولية البشرية

  1. بعد استئصال المبيض ، ضع المبيضين في 0.9٪ كلوريد الصوديوم أو محلول ملحي معقم مماثل وانقله إلى المختبر على الجليد.
  2. نقل المبايض الفردية إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 2-3 مل من وسط الهضم (الجدول 1) أو ما يكفي لتغطية المبيض.
    تنبيه: إذا لم يكن المبيض سليما (تم قطع جزء من العضو للتحليل النسيجي) ، فمن الضروري عدم تغطية هذا الجزء بوسط الهضم.
  3. ضع الأنبوب في حمام خرز دافئ مسبقا (أو حمام مائي) على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. انقل المبيض بعناية إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على 10 مل من وسط التجميع (الجدول 1).
  5. اكشطي سطح المبيض الذي يحتوي على خلايا hOSE برفق باستخدام مكشطة خلوية. اغسل الكاشطة في الوسط وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل (الشكل 1).
    تنبيه: إذا لم يكن المبيض سليما ، فتجنب كشط المنطقة المتضررة وغمرها لتقليل التلوث بأنواع الخلايا غير المرغوب فيها.
  6. انقل خلايا hOSE في وسط التجميع إلى أنبوب سعة 15 مل.
  7. قم بتدوير خلايا hOSE عند 240 × جم لمدة 5 دقائق.
    1. إذا أظهرت الحبيبات لونا أحمر ، مما يدل على التلوث بخلايا الدم الحمراء (RBC) ، فأعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء. احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) مع ماصة عرضية ، أضف 4 مل من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS +/+) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 240 × جم لمدة 5 دقائق. إذا استمر RBC ، كرر هذه الخطوة.
  8. حفظ حبيبات خلية hOSE بالتبريد (القسم 2) ، استخدمها للثقافة ثنائية الأبعاد (القسم 3) أو المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (القسم 4) (الشكل 1).

2. الحفظ بالتبريد - ذوبان خلايا hOSE

  1. الحفظ بالتبريد
    1. أعد تعليق حبيبات خلية hOSE في 1 مل من وسائط تجميد الخلايا.
    2. نقل تعليق الخلية إلى cryovials (2x cryovials لكل مبيض).
    3. ضع الكريوفيال في وعاء تجميد وضعه في -80 درجة مئوية طوال الليل.
    4. انقل المبردات المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
  2. ذوبان الجليد:
    1. إزالة cryovial من النيتروجين السائل.
    2. ضع الكريوفيال في حمام خرز دافئ مسبقا (أو حمام مائي) على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يظهر قلب صغير مجمد فقط داخل المبرد.
    3. ماصة تعليق خلية hOSE في أنبوب 15 مل مع 10 مل من وسط التجميع (الجدول 1).
    4. أجهزة الطرد المركزي في 240 × ز لمدة 5 دقائق.
    5. استخدم حبيبات خلية hOSE للثقافة ثنائية الأبعاد (القسم 3) أو المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (القسم 4).

3. ثقافة hOSE ثنائية الأبعاد في طبقة أحادية

  1. أعد تعليق حبيبات hOSE في 1 مل من OSE_2D الوسط (الجدول 1) وانقلها إلى بئر واحدة من صفيحة ذات 12 بئرا.
  2. أضف 1 مل إضافي من OSE_2D الوسط إلى البئر وزرعه عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة (5٪ CO2) لمدة 72 ساعة لضمان التصاق خلايا hOSE قبل تغيير الوسائط الأولى.
  3. قم بتحديث الوسائط كل 2-3 أيام حتى تصل خلايا hOSE إلى التقاء 70٪ -90٪ (P0) (الشكل 2A).
    ملاحظة: إذا كانت كرات الدم الحمراء لا تزال موجودة في المزرعة ، إزالتها أثناء تغيير الوسائط الأول ، وستظل خلايا hOSE فقط متصلة بالبئر.
  4. لتمرير خلايا hOSE ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. إزالة الوسائط الثقافية من البئر.
    2. يغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني معقم.
    3. قم بإزالة برنامج تلفزيوني وأضف ما يكفي من 0.05٪ تربسين / إيدتا لتغطية الخلايا.
    4. ضع الطبق على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة (5٪ CO2) لمدة 4-7 دقائق حتى تلاحظ تقريب الخلايا وانفصالها عن البئر.
    5. أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 1 مل من وسط التجميع.
    6. اجمع خلايا hOSE وأجهزة الطرد المركزي عند 240 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. خلايا البذور في بئر جديدة بالكثافة المطلوبة ، قم بتحديث الوسائط كل 2-3 أيام حتى تصل خلايا hOSE إلى التقاء 70٪ -90٪ ، وكرر الخطوة 3.4.
      ملاحظة: يمكن زراعة خلايا hose الأولية حتى ثلاثة ممرات. بعد ذلك ستصبح معظم الخلايا شيخوخة (الشكل 2 أ).
  5. استخدم خلايا hOSE الموسعة لمزيد من التوصيف باستخدام التألق المناعي (الشكل 2B) لاختبار تأثيرات وسائط الاستزراع (الشكل 2C) أو للعضويات ثلاثية الأبعاد (القسم 4).

4. 3D ثقافة hOSE العضوية

  1. قم بتسخين الشريحة متعددة الحجرات مسبقا عند 37 درجة مئوية.
  2. عد خلايا hOSE (المعزولة حديثا أو المحفوظة بالتبريد المذابة) باستخدام عداد الخلايا الآلي أو يدويا باستخدام مقياس الدم.
  3. أعد تعليق العدد المطلوب من خلايا hOSE إلى 1 مل من الوسط الأساسي العضوي OSE المثلج البارد (الجدول 1) في أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 240 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق حبيبات hOSE بالكمية المطلوبة من محلول مستخلص الغشاء القاعدي غير المخفف (BME) للحصول على تركيز خلية 1 × 104 خلايا / 10 ميكرولتر من BME.
  6. حل ماصة hOSE-BME لأعلى ولأسفل لضمان التوزيع المتجانس.
  7. اصنع 10 ميكرولتر من قطرات محلول hOSE-BME لكل بئر في الشريحة متعددة الحجرات التي تم تسخينها مسبقا.
    ملاحظة: تأكد من وجود كل قطرة في وسط البئر للحصول على شكل قطرة.
  8. ضع الطبق مع القطرات رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة (5٪ CO2) لمدة 15 دقيقة للسماح بتصلب الهلام.
  9. أضف 100 ميكرولتر من OSE_3D الوسط (الجدول 1) والاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة (5٪ CO2).
  10. قم بتحديث الوسيط كل 3-4 أيام.
    ملاحظة: تستمر عضويات hOSE في النمو على الأقل حتى 28 يوما في الثقافة (الشكل 3 أ ، ب) ، ولكن ينصح بالمرور كل 14-28 يوما (معدل النمو يعتمد على المتبرع ، طازجا مقابل hOSE بالتبريد) لتحفيز تكاثر الخلايا وبقاء الأعضاء. تم تمرير ثلاثة خطوط عضوية hOSE مستقلة 4 مرات على الأقل دون علامات الشيخوخة. تظهر عضويات hOSE أشكالا مختلفة (الشكل 3C).
  11. لتمرير عضويات hOSE:
    1. قم بإزالة الوسط وإضافة 100 ميكرولتر من DMEM / F12 المتقدم المثلج البارد إلى كل بئر.
    2. اكشط قاع الآبار بطرف ماصة P1000 لفصل قطرات الهلام.
    3. انقل كل قطرة جل عائمة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب مع قطرات هلام في 240 × غرام لمدة 5 دقائق.
    5. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا ، وضع الأنابيب في حمام حبة دافئ مسبقا (أو حمام مائي) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: إذا بقيت بعض الكائنات العضوية سليمة ، فإن الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام طرف ماصة مصل بقري مغطى بالجنين وبارد لتعطيلها ميكانيكيا. طلاء أطراف الماصة بمصل الجنين البقري يمنع المواد العضوية من الالتصاق بالطرف.
    6. أضف 300 ميكرولتر من الوسط الأساسي العضوي hOSE وأجهزة الطرد المركزي عند 240 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. أعد تعليق الحبيبات بالكمية المطلوبة من محلول BME غير المخفف ، وأعد بذرها بنسبة مناسبة (وزع محتوى قطرة واحدة في 1-4 قطرات) ، واستزراعها كما هو مذكور أعلاه.
      ملاحظة: لا يتم فصل الكائنات العضوية إلى خلايا مفردة ، وبالتالي ، لا يمكن حساب الخلايا بدقة لمزيد من المرور.

5. تألق مناعي كامل التركيب لعضويات hOSE ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: يمكن إجراء التألق المناعي الكامل في نفس البئر (في القطرة) في حالة استخدام شرائح متعددة الحجرات مناسبة لتقنيات الفحص المجهري.

  1. ثبت عضويات hOSE في القطرات في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في RT.
  2. اغسل مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT على منصة دوارة / اهتزازية.
  3. قم بنفاذ عضويات hOSE في القطرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول النفاذية (الجدول 1) لمدة 15 دقيقة عند RT.
  4. اغسل ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (الجدول 1) لمدة 15 دقيقة عند RT وقم بحظره طوال الليل (o / n) عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة / اهتزازية.
  5. احتضان مع 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية المخففة في العازلة المانعة عند 4 درجات مئوية o / n على منصة دوارة / اهتزاز.
    ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالأجسام المضادة الأولية المستخدمة ، ونوع الخلية المحدد ، والنموذج الحيواني المستخدم للتحقق من صحة التعبير12،19،20،21،22،23،24،25.
  6. أحضر اللوحة إلى RT واغسلها ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 15 دقيقة في RT على منصة دوارة / اهتزازية.
  7. احتضان مع 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية المخففة في عازلة مانعة لمدة 2 ساعة في RT على منصة دوارة / اهتزاز ، ولكن محمية من الضوء.
    ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. للحماية من الضوء ، ضع اللوحة داخل صندوق مظلم أو قم بتغطيتها بورق الألمنيوم.
  8. اغسل ثلاث مرات في 100 ميكرولتر من PBS لمدة 15 دقيقة في RT على منصة دوارة / اهتزاز.
  9. قم بتخزين اللوحة في درجة حرارة 4 درجات مئوية مغطاة بورق الألمنيوم حتى التصوير (الشكل 4).

6. القياس الكمي لحجم hOSE العضوي

  1. التقط صورا ساطعة 10x (صورة TIFF) على المجهر.
  2. قم بتنزيل وتثبيت Fiji (https://imagej.net/software/fiji/)26.
  3. قياس منطقة صورة hOSE العضوية باستخدام برنامج ImageJ فيجي:
    1. تحميل ملفات TIFF الصورة في فيجي.
    2. قم بإنشاء عتبة للبرنامج للتعرف على المواد العضوية hOSE (المنطقة الداكنة) في صورة برايت فيلد التي تم تحميلها بالنقر فوق > الصورة ضبط عتبة >. اضبط القيم أدناه وما فوق حتى تتم إزالة معظم الخلفية ويتم الاحتفاظ بالمواد العضوية الفردية.
    3. افتح أداة عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل أداة > > عائد الاستثمار.
    4. حدد أداة العصا وانقر على المنطقة باستخدام عضوي hOSE حتى ترى خطا أصفر يحيط بمحيط العضو بالكامل. في لوحة عائد الاستثمار، انقر فوق إضافة وقياس للحصول على قيمة مساحة هذا العضوي OSE.
    5. كرر الخطوة 6.3.4. لكل عضوي hOSE ليتم قياسه.

النتائج

ثقافة 2D hOSE
تم طلاء خلايا hOSE المعزولة حديثا على صفيحة من 12 بئرا واستزراعها لمدة 3 أسابيع. خلال هذه الفترة ، تم تمرير الخلايا ثلاث مرات (الشكل 2 أ). أظهرت خلايا hOSE الأولية في المستنبتة مورفولوجيا تشبه الحصى حتى الممر 3 (P3) ولكن بعد ذلك بدأت تظهر علامات الشيخوخة ، وفقا للنتائج السابقة التي أبلغت عن الفترة المحدودة hOSE يمكن تمريرها27. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن OSE الفئران يخضع للانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في المختبر ، حيث يعرض ميزات تشبه الخلايا الليفية مثل إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للأكتين وترسب الكولاجين I19. بالاتفاق ، أظهر ACTA2 + CD44 + hOSE تنظيما واضحا ل COL1A1 بين P2 و P3 (الشكل 2B) ، مما يشير إلى أن خلايا hOSE تخضع ل EMT أثناء الثقافة.

إشارات TGF-β هي منظم رئيسي ل EMT28 قادر على تحفيز EMT في أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية29. على الرغم من عدم إضافة TGF-β إلى وسائط OSE_2D ، إلا أن FBS المضافة يمكن أن تحتوي على مستويات يمكن اكتشافها من هذا السيتوكين30,31. لهذا السبب ، اختبرنا ما إذا كانت إضافة مستقبلات مثبطات TGF-β من النوع الأول SB-431542 يمكن أن تمنع EMT ، مما يسمح بثقافة 2D لفترات طويلة. والمثير للدهشة أن مكملات الوسائط OSE_2D ب 10 ميكرومتر من SB-43154232أعاقت تكاثر الخلايا (الشكل 2C). خلصنا إلى أن إشارات TGF-β ضرورية لانتشار OSE ، وتم إجراء المزيد من تجارب ثقافة 2D بدون المانع.

3D hOSE الثقافة العضوية
استنادا إلى ظروف الاستزراع المنشورة لزراعة عضويات OSE البشرية12 ، قمنا باشتقاق عضويات hOSE المضمنة في قطرات BME ونمت في وسط OSE_3D (يحتوي على تركيز قياسي قدره 100 نانومتر من استراديول) لمدة تصل إلى 28 يوما. في غضون 7 أيام ، كانت العديد من عضويات hOSE المشتقة من خلايا OSE المعزولة حديثا كيسي بمتوسط قطر 130 مم (الشكل 3 أ ، ب). كانت هذه النتائج مشابهة لتلك التي أبلغ عنها كوبر وزملاؤه حول اشتقاق عضويات hOSE من أنسجة المبيض البشري المفرومة والمهضومة إنزيميا12. ومن المثير للاهتمام ، أن عضويات hOSE المشتقة من خلايا OSE المعزولة حديثا نمت أكبر (متوسط قطر 160 مم) من عضويات hOSE من خلايا OSE الموسعة ثنائية الأبعاد (متوسط قطر 100 مم) بعد 14 يوما في الثقافة (الشكل 3 ب) ، ربما بسبب ميل خلايا OSE الموسعة ثنائية الأبعاد لتقليل الانتشار. علاوة على ذلك ، في حين أن العديد من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد hOSE تتكون من طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المسطحة (الشكل 3C أعلى اللوحة اليسرى) ، أظهر بعضها طبقة أحادية مكعبة من الخلايا (الشكل 3C أعلى اللوحة اليمنى) ، والبعض الآخر متعدد الطبقات (الشكل 3C اللوحة اليمنى السفلية) أو شكلت مجموعة خلايا غير مزخرفة (الشكل 3C أسفل اللوحة اليسرى).

لاختبار ما إذا كان يمكن أيضا اشتقاق عضويات hOSE باستخدام OSE_2D الوسط ، تم تضمين خلايا hOSE المعزولة حديثا في قطرات BME ونمت في وسائط OSE_2D لمدة 12 يوما. بعد 6 أيام ، كانت الخلايا الشبيهة بالمغزل مرئية ، مما يشير إلى أن خلايا hOSE كانت تخضع ل EMT في القطرات. الأهم من ذلك ، لم يتم تشكيل أي عضويات hOSE باستخدام وسيط OSE_2D (الشكل 3D).

الخصائص الخلوية لعضويات hOSE
في المبيض البشري البالغ ، يشير الكيراتين 8 (KRT8) على وجه التحديد إلى مجموعة OSE (الشكل 4A) ، وبالتالي ، احتفظت عضويات hOSE بتعبير KRT8 ، للتحقق من صحة هويتها الخلوية (الشكل 4B). في خلايا OSE للفأر ، ارتبط التوطين النووي للبروتين المرتبط ب Yes1 (YAP1) على وجه التحديد بالخلايا الجذعية / السلفية OSE القادرة على توسيع وشفاء المنطقة المصابة بعد الإباضة24,33. أظهر YAP توطينا نوويا في غالبية الخلايا في عضويات hOSE بغض النظر عن حجمها (الشكل 4B). كما تم التحقيق في علامات أخرى تم الإبلاغ عنها في خلايا OSE للفأر ، مثل CD4420 و LGR522. ومن المثير للاهتمام ، تم التعبير عن كل من CD44 و LGR5 في عضويات hOSE صغيرة (قطرها <100 ميكرومتر) ، بينما في المواد العضوية الأكبر حجما ، بدا CD44 و LGR5 منخفضي التنظيم (الشكل 4B).

بعد ذلك ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت الكائنات العضوية hOSE تعرض القطبية القمية القاعدية التي لوحظت عادة في الكائنات العضوية المضمنة في BME (القمي في)34. تم استخدام البروتين القاعدي إنتغرين بيتا 1 (ITGB1) والبروتين القمي بودوكاليكسين (PODXL) لإظهار قطبية الخلية في عضويات hOSE ، مما يؤكد قطبية قمية واضحة مستقلة عن حجم العضو العضوي hOSE (الشكل 4B).

من المعروف أن OSE البشري يعبر عن علامة اللحمة المتوسطة N-cadherin (CDH2) ، في حين أن التعبير عن العلامة الظهارية E-cadherin (CDH1) يقتصر على خلايا OSE العمودية (الشكل 4A) 2. ومن المثير للاهتمام ، أن عضويات hOSE المشتقة في هذا العمل عبرت عن علامات اللحمة المتوسطة CDH2 و vimentin (VIM) ، وكانت عضويات hOSE الكيسية الكبيرة ذات الظهارة المكعبة / العمودية CDH1 + و CDH2 + VIM + (الشكل 4C). لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت عضويات CDH1 + hOSE مشتقة من خلايا CDH1 + OSE الأولية أو من خلايا CDH1- OSE التي خضعت للتمايز الظهاري أو التحول (الأورام) في المختبر25,35.

عرض استخدام عضويات hOSE: تأثير إشارات التبويض على عضويات hOSE
يمكن استخدام الهرمونات المحفزة للجريب وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية لتحفيز نمو الجريبات والإباضة ، بينما بعد الإباضة ، هناك زيادة ملحوظة في تركيز الهرمونات المنتجة من المبيض ، مثل البروجسترون والإستراديول36. لعرض قابلية استخدام عضويات hOSE كمنصة فحص ، قمنا بفحص تأثير هذه الهرمونات على عضويات hOSE ، باستخدام عدد وحجم الكائنات العضوية كناتج كمي (باستخدام فيجي). لهذا ، اشتقنا عضويات hOSE في OSE_3D الوسائط التي تفتقر إلى استراديول (بدون هرمون) وفي OSE_3D الوسائط التي تحتوي على FSH أو hCG أو استراديول أو البروجسترون بتركيزات مختلفة (الشكل 5 أ).

تم تحديد عدد عضويات hOSE المشتقة من خلايا hOSE المذابة المحفوظة بالتبريد (غير الموسعة) من 3 متبرعين مختلفين (n = 3) لكل قطرة بعد 7 أيام من المزرعة (الشكل 5A ، B). تم تغيير وسائل الإعلام الثقافية كل 3 أيام. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في العدد الإجمالي لعضويات hOSE لكل قطرة تشكلت في هرمونات متوسطة تحتوي على وسط مقارنة بالوسط بدون هرمونات (الشكل 5 أ ، ب). لتحديد تأثير الهرمونات على حجم الأعضاء ، بعد 14 يوما في الثقافة ، تم تصوير كل قطرة (من كل حالة) ، وتم قياس مساحة أكبر 4 عضويات hOSE باستخدام فيجي. ومن المثير للاهتمام ، أن توليد عضويات hOSE من متبرعين مختلفين (n = 2) في وجود البروجسترون (1000 نانومتر) أو استراديول (200 نانومتر) أدى إلى عضوي واحد كبير جدا على الأقل (قطره حوالي 700 ميكرومتر) لكل قطرة (الشكل 5C ، D).

figure-results-7225
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لعزل خلايا hOSE عن المبيضين الكاملين. تم تحضين المبايض في محلول الهضم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم فصل خلايا hOSE عن سطح المبيض عن طريق كشطها بلطف وحفظها بالتبريد لاحقا ، أو مطلية مباشرة على ثقافة 2D OSE في طبقة أحادية ، أو مضمنة في مستخلص الغشاء القاعدي (BME) لثقافة 3D hOSE العضوية. يمكن استخدام خلايا hOSE المذابة المحفوظة بالتبريد لثقافة 2D أو تكوين عضوي ثلاثي الأبعاد ، ويمكن استخدام خلايا hOSE الموسعة ثنائية الأبعاد لتوليد عضويات hOSE ثلاثية الأبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8053
الشكل 2: الثقافة الأولية ثنائية الأبعاد لخلايا hOSE. (أ) صور برايتفيلد لخلايا hOSE في الممرات 0 (P0) و 2 (P2) و 3 (P3) التي تصور مورفولوجيا الحصى الظهارية النموذجية. قضبان المقياس 750 ميكرومتر على الألواح العلوية و 125 ميكرومتر على الألواح السفلية. (ب) التألق المناعي ل ACTA2 و CD44 و COL1A1 على خلايا hOSE ثنائية الأبعاد عند P2 و P3. قضبان المقياس هي 50 ميكرومتر. (C) صور برايتفيلد لخلايا hOSE المزروعة ب 10 ميكرومتر من SB-431542 عند P0 و P2 و P3. أظهرت الخلايا علامات الشيخوخة من P2 ولم تصل إلى التقاء عال أثناء الثقافة. قضبان المقياس 750 ميكرومتر على الألواح العلوية و 125 ميكرومتر على الألواح السفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9051
الشكل 3: التوصيف المورفولوجي لعضويات hOSE. (أ) صور برايتفيلد لثلاثة اشتقاقات عضوية hOSE مستقلة من ثلاثة مانحين مختلفين (tOVA86 ، tOVA87 ، tOVA88). تم التقاط الصور بعد تضمين الخلية (D0) واليوم 7 (D7) واليوم 14 (D14) واليوم 28 (D28) من الثقافة. قضبان المقياس هي 750 ميكرومتر عند D0 و 50 ميكرومتر للباقي. (ب) قطر عضويات hOSE المشتقة من خلايا hOSE المعزولة حديثا (الخط المتقطع) وخلايا hOSE الموسعة 2D (الخط الصلب). الموضح هو متوسط حجم الانحراف المعياري ± قياسه عند D0 وD7 وD14. يتم عرض النتائج من متبرعين مختلفين (tOVA88 و tOVA89). (ج) صور برايتفيلد لعضويات hOSE تظهر أشكالا مختلفة: طبقة مسطحة واحدة (أعلى اليسار) ، طبقة عمودية واحدة (أعلى اليمين) ، متعددة الطبقات (أسفل اليمين) ، ومجموع الخلايا غير اللومينية (أسفل اليسار). قضبان المقياس هي 100 ميكرومتر. (د) صور برايتفيلد لخلايا hOSE المضمنة في BME والمزروعة لمدة 12 يوما باستخدام وسائط OSE_2D. تم التقاط الصور بعد تضمين الخلية (D0) واليوم 6 (D6) واليوم 9 (D9) واليوم 12 (D12). تفوقت الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية على الثقافة ، ولم يتم تشكيل أي هياكل شبيهة بالعضوية. قضبان المقياس 750 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10506
الشكل 4: التوصيف الخلوي لعضويات hOSE. أ: التألق المناعي ل KRT8 و CDH1 في قسم المبيض البشري. شريط المقياس على اللوحة اليسرى هو 500 ميكرومتر ، والألواح الوسطى واليمنى 50 ميكرومتر. (ب) التألق المناعي ل KRT8 و YAP و LGR5 و CD44 و ITGB1 و PODXL في عضويات hOSE بأحجام مختلفة (<50 ميكرومتر ، 50-75 ميكرومتر ، 75-100 ميكرومتر ، >100 ميكرومتر). قضبان المقياس هي 50 ميكرومتر. (ج) التألق المناعي ل VIM و CDH1 و CDH2 في عضويات hOSE. قضبان المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-11346
الشكل 5: تأثير إشارات التبويض على تكوين عضوي hOSE. (أ) إجمالي عدد عضويات hOSE لكل قطرة تشكلت في اليوم 7 في وسائط الاستزراع المختلفة. تم اشتقاق عضويات hOSE من ثلاثة مانحين مختلفين (tOVA77 ، tOVA79 ، tOVA83). بالخط العريض هو الوسيط OSE_3D المستخدم في اشتقاق المواد العضوية. ب: التكوين العضوي النسبي مقارنة بالوسط الذي لا يحتوي على هرمونات. تم اشتقاق القيم المجمعة من عضويات hOSE من ثلاثة مانحين مختلفين (tOVA77 ، tOVA79 ، tOVA83). (ج) رسم بياني يصور منطقة الصورة لأكبر 4 عضويات hOSE في اليوم 14 في كل حالة من الظروف التجريبية التي تم اختبارها من متبرعين مختلفين (tOVA77 ، tOVA83). (د) صور برايتفيلد تظهر عضويات hOSE في اليوم 14 مع وسط بدون هرمونات ، 200 نانومتر E2 ، و 1000 نانومتر P4 من متبرعين مختلفين (tOVA77 ، tOVA83). قضبان المقياس 750 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين حلول العمل المستخدمة في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

تظهر تقنية 3D organoid كأداة لا غنى عنها للبحث الطبي. من ناحية ، توفر هذه المنصة في المختبر إمكانية دراسة الأسئلة الميكانيكية الأساسية حول تجديد الأنسجة والتئام الجروح والتنمية18. من ناحية أخرى ، تسمح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد المشتقة من عينات المرضى بدراسات الطب الشخصي ، بما في ذلك التشخيص واختبار الأدوية والعلاج الخلوي12،13،14،37،38. في مجال أبحاث المبيض ، اكتسب hOSE اهتماما كبيرا منذ تأثيره كأصل لسرطان المبيض الظهاري39. على الرغم من أنه يعتقد أن معظم سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) ، وهو أحد أكثر سرطانات المبيض الظهارية شيوعا ، ينشأ من قناة فالوب40 ، فقد اقترحت الأبحاث الحالية على الفئران عضويات المبيض 3D أصل مزدوج محتمل ل HGSOC من OSE وقناة فالوب 15,16.

هنا ، وصفنا بروتوكولا لاشتقاق عضويات hOSE 3D وحددنا تطبيقه لجلب معرفة ميكانيكية جديدة في تجديد أنسجة المبيض. يتضمن هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لعزل خلايا hOSE الأولية من المبايض البشرية وتوليد عضويات hOSE 3D. لضمان اشتقاق عضوي hOSE بكفاءة ، من الضروري تقليل التلاعب بالمبيض. نظرا لموقعه على سطح المبيض والتنظيم أحادي الطبقة ، فإن hOSE عرضة للتلف والخسارة أثناء استئصال المبيض والتلاعب بالأعضاء. لهذا السبب ، فضلنا طريقة إنزيمية وكشط مطبقة على المبيض بأكمله لعزل hOSE 2,8. في البروتوكول الحالي ، تم تطبيق علاج إنزيمي خفيف لتعطيل اتصالات hOSE بين الخلايا ، يليه كشط لطيف لسطح المبيض.

بمقارنة 2D مع ثقافة hOSE ثلاثية الأبعاد ، من المهم ملاحظة أنه على الرغم من معدل الانتشار المرتفع الأولي لخلايا hOSE في ثقافة 2D ، فقد تغيرت خصائصها الخلوية بسبب EMT ، مما يشير إلى أن ظروف الثقافة ثنائية الأبعاد المطبقة ليست مناسبة للحفاظ على مورفولوجيا ظهارية. على النقيض من ذلك ، يمكن تمرير المواد العضوية 3D hOSE 4 مرات على الأقل دون علامات الشيخوخة. استندت OSE_3D وسائط الثقافة العضوية المستخدمة إلى تلك المستخدمة من قبل كوبر وزملائه لاشتقاق OC وعضويات hOSE الصحية12 ومن قبل كيسلر وزملاؤه لاشتقاق عضويات FT البشرية17. كان الاختلاف الرئيسي هو استبدال الوسائط البشرية المشروطة Wnt3a و R-Spondin-1 ببروتينات مؤتلفة متاحة تجاريا لتسهيل التكاثر.

تتضمن تقنيات التألق المناعي عادة إزالة عينة الأنسجة من صفيحة المزرعة ومعالجتها لتقسيم البارافين أو التبريد. عند العمل مع هياكل صغيرة جدا ، يكون خطر فقدانها أثناء معالجة العينات مرتفعا. في هذا البروتوكول ، يحدث اشتقاق عضويات hOSE في لوحات زراعة الخلايا التي تسمح بالتصوير المجهري المباشر دون الحاجة إلى إزالة عضويات hOSE من مصفوفة BME. علاوة على ذلك ، فإن طريقة التألق المناعي الكاملة المستخدمة هنا ، والتي وصفها ريزان نجاد وزملاؤه لعضويات البنكرياسالأقنية 41 ، مكنت في الموقع من مراقبة توطين البروتين داخل عضويات سليمة شكليا. لقد أثبتنا أنه عند إجراء بروتوكول التألق المناعي هذا على عضويات hOSE المشتقة في شرائح متعددة الغرف بشكل جيد ، هناك اختراق عالي الكفاءة للأجسام المضادة مع إشارة خلفية منخفضة للغاية.

على الرغم من أن معظم عضويات hOSE المشتقة باستخدام هذه الطريقة تفتقر إلى تعبير CDH1 ، إلا أن بعض عضويات CDH1 + hOSE تشكلت ، ووصلت إلى أحجام أكبر مقارنة بعضويات CDH1- hOSE. ارتبط تعبير CDH1 بالأنماط الظاهرية hOSE الورمية 2,35. تم التبرع بالمبيضين المستخدمين لعزل hOSE من قبل متبرعين أصحاء متحولين جنسيا في سن الإنجاب (27.1 ± 5 سنوات). كان هؤلاء المتبرعون يخضعون لعلاج التستوستيرون لمدة 38 ± 15 شهرا قبل استئصال المبيض. لا يمكننا تجاهل احتمال أن خلايا CDH1 + hOSE على سطح المبيض يمكن أن تعزى إلى علاج التستوستيرون. على الرغم من أن علاج الأندروجين قد ارتبط بتغيرات المبيض ، مثل الإباضة42 ، وتضخم المنطقة القشرية43 ، وزيادة الصلابة القشرية44 ، إلا أن أمراض المبيض العامة تظل حميدة أثناء استخدام هرمون التستوستيرون45.

باختصار ، يسلط هذا البروتوكول الضوء على إمكانية توليد عضويات hOSE 3D لفك تشفير الأسئلة الميكانيكية حول تجديد أنسجة المبيض. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة للكشف عن الخلايا الخبيثة الموجودة في خزعات المبيض من المرضى المعرضين لخطر الإصابة بالسرطان. بشكل جماعي ، تدعم هذه الطريقة التطبيقات المحتملة لهذه المنصة المبتكرة في المختبر لكل من دراسات وظائف المبيض الأساسية والتطبيقات السريرية للعلاجات الطبية الفردية.

Disclosures

اي.

Acknowledgements

نود أن نشكر جميع المرضى الذين تبرعوا بالأنسجة لهذه الدراسة ، وأعضاء مجموعة Chuva de Sousa Lopes على المناقشات المفيدة ، و I. De Poorter لتصميم الرسوم الكاريكاتورية المستخدمة في الشكل 1. تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، رقم المنحة ERC-CoG-2016- 725722 (OVOGROWTH) ل J.S.D.V. و S.M.C.d.S.L. ؛ ومؤسسة نوفو نورديسك (reNEW) ، رقم المنحة NNF21CC0073729 ل J.S.D.V. و S.M.C.d.S.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin/EDTAInvitrogen25200-056
12-well Culture PlateCorning3336Sterile
15 mL tubesGreiner188271Sterile
28cm Cell ScraperGreiner Bio-One541070
50 mL tubesGreiner227261Sterile
60 mm Petri dishGreiner Bio-One628160
A83-01Stem Cell Technologies72024
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504-044
Bead bathM714
Bovine serum albumin (BSA)Sigma Aldrich10735086001
Cell Dissociation BufferThermoFisher Scientific13151014
Cryo-container "Mr. Frosty"BD Falcom479-3200
DMEM MediumThermoFisher Scientific41966-029
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647Invitrogen A-21447
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21202
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 InvitrogenA-21206
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21207
Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647 Invitrogen A-21448
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher ScientificA4736401
Follicle Stimulating Hormone (FSH)Sigma AldrichF4021
Forskolin Peprotech6652995
Glutamax (100x)Gibco35050-038
Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin)Santa Cruz SC-1502Mesenchymal Cells; Wong et al 1999 (human)25
Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135)R&D Systems AF1658Apical Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434
hEGFR&D Systems263-EG
HEPESGibco15630-056
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x)ThermoFisher Scientific51500-056
Liberase DH Research GradeSigma AldrichA4736401
Luna-II  cell counterLogos BiosystemsL40001
MatrigelSigma Aldrich354277
McCoy’s 5A Medium ThermoFisher Scientific26600-023
Mouse anti-ITGB1 (integrin beta 1)Santa Cruz SC-53711Basolateral Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Mouse anti-KRT8 (cytokeratin 8)Santa Cruz SC-101459OSE Cells; Kopper et al 2019 (human)12
Mouse anti-VIM (vimentin)Abcam AB0809Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Mycozap Plus-CLLonzaV2A-2011
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G
OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG)MerkG03GA08
Progesterone (P4)Sigma AldrichP8783
Rabbit anti-ACTA2 (alpha smooth muscle actin)Abcam AB5694Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Rabbit anti-CDH1 (E-cadherin)Cell Signaling CST 3195SEpithelial Cells; Wong et al 1999 (human)25
Rabbit anti-LGR5Abcam AB75850OSE Progenitor Cells; Flesken-Nikitin et al 2013 (mouse)22
Rabbit anti-YAPCell Signaling 14074SProliferative OSE; Wang et al 2022 (mouse)24
Rat anti-CD44 PE-conjugatedeBioscience12-0441-81OSE Progenitor Cells; Bowen et al 2009 (human)20
Recombinant Human Heregulinβ-1Peprotech100-03
Recombinant Human NogginPeprotech120-10C
Recombinant Human Wnt3aR&D Systems5036-WN-010
Recombinant Rspondin-1  Peprotech120-38
Red blood cells lysis buffereBiosciences00-4333-57
Revitacell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA26445-01
RNAse free DNAseQiagen79254
SB-431542Tocris Bioscience1624/10
Sheep anti-COL1A1 (pro-collagen 1 alpha 1)R&D Systems AF6220Mesenchymal Cells; Hosper et al 2013 (human)23
Y-27632 StemCell Technologies72304
β-Estradiol (E2)Sigma-AldrichE8875
μ-Slide 18-well culture plateIbidi8181Sterile

References

  1. Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (10), 625-638 (2015).
  2. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22 (2), 255-288 (2001).
  3. Tan, O. L., Fleming, J. S. Proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity in the ovarian surface epithelium of mice of varying ages and total lifetime ovulation number following ovulation. Biol Reprod. 71 (5), 1501-1507 (2004).
  4. Carter, L. E., et al. Transcriptional heterogeneity of stemness phenotypes in the ovarian epithelium. Commun Biol. 4 (1), 527 (2021).
  5. Chumduri, C., Turco, M. Y. Organoids of the female reproductive tract. J Mol Med (Berl). 99 (4), 531-553 (2021).
  6. Edmondson, R. J., Monaghan, J. M., Davies, B. R. The human ovarian surface epithelium is an androgen responsive tissue. Br J Cancer. 86 (6), 879-885 (2002).
  7. Karlan, B. Y., Jones, J., Greenwald, M., Lagasse, L. D. Steroid hormone effects on the proliferation of human ovarian surface epithelium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 173 (1), 97-104 (1995).
  8. Nakamura, M., Katabuchi, H., Ohba, T., Fukumatsu, Y., Okamura, H. Isolation, growth and characteristics of human ovarian surface epithelium. Virchows Arch. 424 (1), 59-67 (1994).
  9. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).
  10. Del Valle, J. S., Chuva de Sousa Lopes, S. M. Bioengineered 3D ovarian models as paramount technology for female health management and reproduction. Bioengineering (Basel). 10 (7), 832 (2023).
  11. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  12. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  13. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  14. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121.e7 (2023).
  15. Lohmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat Commun. 11 (1), 2660 (2020).
  16. Zhang, S., et al. Both fallopian tube and ovarian surface epithelium are cells-of-origin for high-grade serous ovarian carcinoma. Nat Commun. 10 (1), 5367 (2019).
  17. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  18. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  19. Abedini, A., Sayed, C., Carter, L. E., Boerboom, D., Vanderhyden, B. C. Non-canonical WNT5a regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition in the mouse ovarian surface epithelium. Sci Rep. 10 (1), 9695 (2020).
  20. Bowen, N. J., et al. Gene expression profiling supports the hypothesis that human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian cancer-initiating cells. BMC Med Genomics. 2, 71 (2009).
  21. Bryant, D. M., et al. A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization. Dev Cell. 31 (2), 171-187 (2014).
  22. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495 (7440), 241-245 (2013).
  23. Hosper, N. A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition in fibrosis: collagen type I expression is highly upregulated after EMT, but does not contribute to collagen deposition. Exp Cell Res. 319 (19), 3000-3009 (2013).
  24. Wang, J., et al. Selective YAP activation in Procr cells is essential for ovarian stem/progenitor expansion and epithelium repair. Elife. 11, e75449 (2022).
  25. Wong, A. S., et al. Constitutive and conditional cadherin expression in cultured human ovarian surface epithelium: influence of family history of ovarian cancer. Int J Cancer. 81 (2), 180-188 (1999).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  28. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19 (2), 156-172 (2009).
  29. Miettinen, P. J., Ebner, R., Lopez, A. R., Derynck, R. TGF-beta induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. J Cell Biol. 127 (6 Pt 2), 2021-2036 (1994).
  30. Danielpour, D., et al. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (SELISAs) quantitate and distinguish two forms of transforming growth factor-beta (TGF-beta 1 and TGF-beta 2) in complex biological fluids. Growth Factors. 2 (1), 61-71 (1989).
  31. Oida, T., Weiner, H. L. Depletion of TGF-beta from fetal bovine serum. J Immunol Methods. 362 (1-2), 195-198 (2010).
  32. Halder, S. K., Beauchamp, R. D., Datta, P. K. A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers. Neoplasia. 7 (5), 509-521 (2005).
  33. Wang, J., Wang, D., Chu, K., Li, W., Zeng, Y. A. Procr-expressing progenitor cells are responsible for murine ovulatory rupture repair of ovarian surface epithelium. Nat Commun. 10 (1), 4966 (2019).
  34. Kawata, M., et al. Polarity switching of ovarian cancer cell clusters via SRC family kinase is involved in the peritoneal dissemination. Cancer Sci. 113 (10), 3437-3448 (2022).
  35. Davies, B. R., Worsley, S. D., Ponder, B. A. Expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin in normal ovarian surface epithelium and epithelial ovarian cancers. Histopathology. 32 (1), 69-80 (1998).
  36. Skory, R. M., Xu, Y., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the ovarian cycle using in vitro follicle culture. Hum Reprod. 30 (6), 1386-1395 (2015).
  37. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  38. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2, 78 (2019).
  39. Ducie, J., et al. Molecular analysis of high-grade serous ovarian carcinoma with and without associated serous tubal intra-epithelial carcinoma. Nat Commun. 8 (1), 990 (2017).
  40. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. J Pathol. 211 (1), 26-35 (2007).
  41. Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids. Curr Protoc Cell Biol. 83 (1), e82 (2019).
  42. Asseler, J. D., et al. One-third of amenorrheic transmasculine people on testosterone ovulate. Cell Rep Med. 5 (3), 101440 (2024).
  43. Ikeda, K., et al. Excessive androgen exposure in female-to-male transsexual persons of reproductive age induces hyperplasia of the ovarian cortex and stroma but not polycystic ovary morphology. Hum Reprod. 28 (2), 453-461 (2013).
  44. De Roo, C., et al. Texture profile analysis reveals a stiffer ovarian cortex after testosterone therapy: a pilot study. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1837-1843 (2019).
  45. Grimstad, F. W., et al. Ovarian histopathology in transmasculine persons on testosterone: A multicenter case series. J Sex Med. 17 (9), 1807-1818 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved