JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب شامل لتحليل العينات التي تم الحصول عليها من قلوب البشر والتي تمتد على المقاييس المجهرية والعيانية.

Abstract

توفر الدراسة التفصيلية للقلوب البشرية غير الفاشلة المرفوضة للزراعة فرصة فريدة لإجراء التحليلات الهيكلية عبر المقاييس المجهرية والعيانية. وتشمل هذه التقنيات إزالة الأنسجة (التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) المعدل الذي يدعم وضع العلامات المناعية للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات) والتلوين المناعي الكيميائي. تشمل إجراءات الفحص بالمنظار التشريح المجسم والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT). تشمل إجراءات الفحص العياني التشريح الإجمالي ، والتصوير الفوتوغرافي (بما في ذلك النقش والمسح التصويري) ، والتصوير المقطعي المحوسب ، والطباعة ثلاثية الأبعاد للتشريح المادي أو الافتراضي أو القلب كله. قبل الفحص العياني ، يمكن إجراء تثبيت التروية بالضغط للحفاظ على بنية 3D والتشكل الفسيولوجي ذي الصلة للقلب. تطبيق هذه التقنيات مجتمعة لدراسة قلب الإنسان فريد من نوعه وحاسم في فهم العلاقة بين السمات التشريحية المتميزة مثل الأوعية الدموية التاجية وتعصيب عضلة القلب في سياق بنية 3D للقلب. يصف هذا البروتوكول المنهجيات بالتفصيل ويتضمن نتائج تمثيلية لتوضيح التقدم المحرز في أبحاث تشريح القلب البشري.

Introduction

نظرا لأن الوظيفة تتبع الشكل ، فإن فهم بنية القلب أمر أساسي لتقدير فسيولوجيته. على الرغم من أن العديد من التحقيقات قد كشفت عن تشريح القلب من micro- إلى macroscales1،2،3 ، لا تزال هناك أسئلة متعددة دون حل ، خاصة تلك المتعلقة بتشريح القلب البشري. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن الدراسات الأساسية التي تركز على التشريح الوظيفي تستخدم بشكل عام قلوب4،5،6 ، والتي غالبا ما تكون متميزة عن قلوب البشر1،7،8. علاوة على ذلك ، تميل كل دراسة فردية ، حتى تلك التي تستخدم عينات قلب الإنسان ، إلى التركيز على هياكل محددة للغاية ، مما يجعل من الصعب تطبيق النتائج في سياق القلب كله. هذا أكثر من ذلك إذا كانت الهياكل المركزة في المقاييس الدقيقة أو المتوسطة ، مثل perinexus9 والضفائر العقدية10.

في هذا السياق ، توفر الدراسة الهيكلية الجهازية لقلب الإنسان المرفوض للزراعة فرصة فريدة ونادرة للحصول على أطلس شامل للهياكل القلبية في التركيز عبر المقاييس المجهرية والعيانية11. تشمل بروتوكولات الفحص المجهري إزالة الأنسجة (التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) المعدل الذي يدعم وضع العلامات المناعية للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات ، iDISCO +) 12،13 ، والتلوين الكيميائي المناعي. تشمل بروتوكولات الفحص بالمنظار التشريح المجسم والتصوير الفوتوغرافي الكلي والمسح المقطعي المحوسب الدقيق (CT). تشمل بروتوكولات الفحص العياني التشريح الإجمالي14 ، والتصوير الفوتوغرافي (بما في ذلك النقش والمسح التصويري) 15،16،17 ، والتصوير المقطعي المحوسب ، والتشريح الافتراضي18 ، والطباعة ثلاثية الأبعاد للتشريح الجسدي أو الافتراضي أو القلب كله17. استعدادا للفحص العياني ، يتم إجراء تثبيت التروية بالضغط للحفاظ على بنية 3D والتشكل الفسيولوجي ذي الصلة للقلب14،19،20،21. التطبيق المشترك لهذه التقنيات فريد وحاسم لربط السمات التشريحية المتميزة في سياق بنية 3D للقلب البشري.

نظرا لأن فرصة الحصول على عينة قلب بشري غير مرضية محدودة للغاية ، فإن النهج متعدد المقاييس الموصوف هنا يزيد من استخدام العينة. من خلال تطبيق الإجراءات المختلفة الموضحة أدناه ، ستوضح النتائج التمثيلية للقارئ كيف يمكن استخدام النتائج لأغراض متعددة ، بما في ذلك الاكتشاف في البحث العلمي11 (تحليلات شاملة لتعصيب القلب ، وتوزيع الضفائر العقدية) ، وتحسين الإجراءات السريرية (محاكاة الأساليب الجراحية والتداخلية) ، والتعليم التشريحي (عرض 3D حقيقي لتشريح القلب).

Protocol

استخدمت هذه الدراسة عينات الأنسجة غير المحددة التي تم جمعها من قلوب بشرية غير فاشلة وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA). تم الحصول على عينات من قلوب غير فاشلة تم رفضها للزرع. كانت القلوب مثقوبة بالضغط ، مثبتة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ، وتم تصويرها قبل معالجة الأنسجة وفقا للطرق التالية. يلخص الشكل 1 مخطط التدفق لترتيب الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. الفحص على نطاق صغير

  1. تطهير الأنسجة باستخدام بروتوكول 3D المعدل الذي يدعم التصوير المناعي للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات (iDISCO +).
    1. قم بتشريح 4٪ من الأنسجة الثابتة PFA بمشرط لتناسب غرفة 3 مم × 16 مم × 25 مم للفحص المجهري متحد البؤر. لتصوير الأنسجة السميكة ، قد يتم تكديس غرف و / أو فواصل إضافية على الشريحة.
    2. تجفيف العينات باستخدام سلسلة الميثانول المتدرج (MeOH) (20٪ ، 40٪ ، 60٪ ، 80٪ ، و 100٪ MeOH في H2O منزوع الأيونات [vol / vol]) لمدة 1 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة (RT) مع التقليب.
    3. اغسل باستخدام 100٪ MeOH لمدة 1 ساعة في RT وانغمس في 66٪ ثنائي كلورو ميثان / 33٪ MeOH في RT مع التقليب طوال الليل.
    4. في اليوم التالي ، اغسل مرتين في MeOH (100٪) لمدة 1 ساعة في RT ، ثم برد عند 4 درجات مئوية ، وعالج ب 5٪ H2O2 في MeOH (المجلد / المجلد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    5. أعد الترطيب باستخدام سلسلة MeOH المتدرجة (80٪ و 60٪ و 40٪ و 20٪ MeOH) واغسلها في 0.01 مول / لتر PBS لمدة 1 ساعة لكل منها في RT مع التقليب.
    6. اغسل المناديل مرتين في 0.01 مول / لتر PBS مع 0.2٪ Triton X-100 لمدة 1 ساعة في RT.
    7. استعد لوضع العلامات المناعية عن طريق النفاذية في 0.01 مول / لتر PBS ، 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، 0.2٪ Triton X-100 ، و 0.3 مول / لتر جليكاين لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع الإثارة.
    8. ضع 0.01 مول / لتر PBS مع 10٪ DMSO و 0.2٪ Triton X-100 و 5٪ مصل حمار عادي لمدة يومين آخرين عند 37 درجة مئوية مع التقليب.
    9. ملصق يحتوي على جسم مضاد أولي متوافق مع MeOH مترافق مع الفلوروفورات المخففة في 0.01 مول / لتر PBS مع 10 مجم / مل من الهيبارين (PTwH) ، 0.2٪ Tween-20 ، 5٪ DMSO ، و 3٪ مصل حمار عادي لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية مع التقليب.
    10. قم بتجديد محلول الأجسام المضادة واحتضانه لمدة 3-4 أيام أخرى عند 37 درجة مئوية مع الإثارة.
    11. بعد حضانة 1 أسبوع في محلول الأجسام المضادة الأولية ، اغسل 4 إلى 5 مرات في PTwH طوال الليل في RT.
    12. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافقة مع الفلوروفورات المخففة في PTwH ، 3 ٪ مصل حمار طبيعي لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية مع التقليب.
    13. تجديد احتضان محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 3 أيام أخرى عند 37 درجة مئوية مع التقليب.
    14. بعد الحضانة لمدة 6 أيام في محلول الأجسام المضادة الثانوي ، اغسل في PTwH 4-5 مرات طوال الليل في RT.
    15. قم بالجفاف باستخدام سلسلة MeOH متدرجة (20٪ و 40٪ و 60٪ و 80٪ و 100٪ و 100٪ MeOH). يمكن تخزين العينة طوال الليل في RT.
    16. احتضان في 66 ٪ ثنائي كلورو ميثان / 33 ٪ MeOH لمدة 3 ساعات في RT مع التقليب.
    17. يغسل مرتين في 100٪ ثنائي كلورو الميثان لمدة 15 دقيقة في RT مع التقليب.
    18. احتضان وتخزين العينات في البنزيل الأثير. املأ الأنبوب لتقليل الهواء من أكسدة العينة.
  2. تصوير عينة مسح الأنسجة
    1. ضع حجرة تحتوي على مادة لاصقة على شريحة وضع طلاء الأظافر حول محيط الغرفة. بالنسبة للأنسجة السميكة ، قد يتم تكديس غرف و / أو فواصل إضافية على الشريحة.
    2. ضع الأنسجة التي تم تطهيرها في الحجرة ، واملأها ببنزيل الأثير ، وقم بتطبيق غطاء.
    3. ضعي طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء لإنشاء ختم.
    4. احصل على صور المسح الضوئي التجانبي ومكدس Z باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر عمودي مع عدسة 5x أو 10x للتصوير على عمق يصل إلى مسافة عمل العدسة.
    5. صورة بدقة 1024 × 1024 باستخدام خطوط الليزر المناسبة لأطياف انبعاث الفلوروفورات المستخدمة. يمكن رؤية التألق الذاتي للعضلات باستخدام خط الليزر 488 نانومتر.
    6. تأكد من أن حجم خطوة المحور z يتناسب مع أخذ عينات Nyquist بناء على الفتحة العددية للهدفالمحدد 11.
    7. غرزة الصور واستخدام البرامج لتصور 3D.
    8. قم بإنشاء أشكال باستخدام صور الإسقاط الأقصى الكثافة (MIP) لمكدسات Z للقنوات الفردية والمدمجة (الشكل 2).
  3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    ملاحظة: بعد أن يتم تضمين الأنسجةفي البارافين 22 ، يتم استخدام الإجراء التالي لإنشاء شرائح للدراسة المناعية الكيميائية.
    1. تحضير محلول مطابقة معامل الانكسار (RIMS).
      1. تحضير 0.1 مول / لتر من الفوسفات العازلة بإضافة 10.9 جم من Na2HPO4 (لا مائي) و 3.1 جم من NaH2PO4 (أحادي الهيدرات) إلى H2O منزوع الأيونات إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر (درجة الحموضة 7.4). قم بتصفية المحلول وتخزينه في RT.
      2. خفف المخزن المؤقت للفوسفات إلى 0.02 مول / لتر.
      3. قم بإذابة Histodenz في 30 مل من محلول فوسفات 0.02 مول / لتر عن طريق تقليب المحلول لمدة 10 دقائق بقضيب تحريك مغناطيسي في زجاجة التخزين النهائية التي قد تكون محكمة الغلق لتقليل التبخر والتلوث.
      4. أضف أزيد الصوديوم إلى تركيز إجمالي قدره 0.01٪ (وزن / حجم) واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
      5. اضبط المثيل المحجوز عن طريق تغيير التركيز النهائي لهيستودينز.
      6. قم بتخزين RIMS في RT لعدة أشهر. تخلص منه إذا لوحظ تلوث ميكروبي.
        ملاحظة: لا الأوتوكلاف أي محاليل تحتوي على أزيد الصوديوم.
    2. إعداد الشرائح للدراسة المناعية الكيميائية
      1. إنشاء أقسام بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. ضع قسم الأنسجة على الشرائح المشحونة.
      2. قم بإزالة البارافين عن طريق احتضان الشرائح في >75٪ زيلين لمدة 10 دقائق. انقل الشرائح إلى حاوية ثانية مع الزيلين لمدة 10 دقائق إضافية.
      3. قم بإزالة الزيلين عن طريق غمر الشرائح في 100٪ EtOH لمدة 10 دقائق ، ثم في 95٪ EtOH لمدة 5 دقائق و 70٪ EtOH لمدة 5 دقائق.
      4. شطف الشرائح مع H2O منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
      5. اغمر الشرائح في المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد لمدة 25 دقيقة عند 90-95 درجة مئوية.
      6. اترك الحاوية لتبرد إلى RT لمدة 1 ساعة مع الإثارة.
      7. اغمر الشرائح في محلول نقع (0.01 مول / لتر PBS + 0.4٪ Triton X-100) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      8. تطويق الأنسجة بقلم PAP. أضف PBS إلى كل شريحة وضعها في غرفة مرطبة لمنع الجفاف.
      9. اغسل الشرائح باستخدام PBS في RT مع التحريك لمدة 5 دقائق.
      10. كتلة مع العازلة حجب (0.01 مول / لتر PBS + 10٪ مصل حمار + 0.1٪ TX-100) لمدة 1 ساعة مع الإثارة.
      11. احتضان مع الجسم المضاد الأولي المخفف في العازلة المانع طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      12. في اليوم التالي ، اترك الشرائح تسخن إلى RT لمدة 15 دقيقة.
      13. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام 0.01 مول / لتر PBS + 0.2٪ TritonX-100 لمدة 5 دقائق.
      14. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي المخفف في منع العازلة لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.
      15. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام 0.01 مول / لتر PBS + 0.2٪ TritonX-100 لمدة 5 دقائق.
      16. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام 0.01 مول / لتر PBS لمدة 5 دقائق.
      17. ضع 1 قطرة من RIMS بالقطارة وقم بتطبيق غطاء الغطاء.
      18. ضعي طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء لإنشاء الختم.
      19. كعنصر تحكم سلبي ، قم بتشغيل عينة بدون الجسم المضاد الأساسي لإثبات عدم وجود تلطيخ محدد.
    3. تصوير الشرائح المناعية
      1. تخيل الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر بعدسات موضوعية 10x و 20x و 40x.
      2. صورة بدقة 1024 × 1024 باستخدام خطوط الليزر المناسبة لأطياف الانبعاث للأجسام المضادة الثانوية المستخدمة.
      3. قم بإنشاء أشكال باستخدام صور الإسقاط الأقصى الكثافة (MIP) لمكدسات Z للقنوات الفردية والمدمجة (الشكل 3).

2. فحص مقياس متوسط

  1. تشريح مجسمة
    1. قم بإجراء تشريح دقيق يركز على الهياكل الصغيرة أو الرقيقة ، مثل العقدة الأذينية البطينية ، وشريان العقدة الأذينية البطينية ، وضفيرة العصب القلبي (مقياس دون المليمتر إلى المليمتر) إما باستخدام مصباح مكتبي مكبرة مع مشبك أو تلسكوبات جراحية أو مجهر مجسم.
  2. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
    ملاحظة: يتم إجراء التصوير المقطعي المحوسب بعد التروية بالضغط والتثبيت وفي أي مرحلة من مراحل التشريح باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الدقيق (PET) / الماسح الضوئي المقطعي المحوسب (الشكل 4).
    1. قم بتسخين مصدر الأشعة السينية المقطعية لمدة 25 دقيقة قبل تصوير العينة.
    2. ضع عينة القلب على سرير الماسح الضوئي.
    3. حرك قاعدة الماسح الضوئي إلى وضع أفقي يبلغ 544 مم وموضع رأسي يبلغ 14 مم لتوسيط القلب في مجال رؤية التصوير المقطعي المحوسب (FOV).
    4. الحصول على صورة CT عند 80 كيلو فولت ، 150 μA ، مع 720 إسقاطا خلال 1 دقيقة من وقت المسح بدقة مكانية تبلغ 200 ميكرومتر.
    5. أعد إنشاء بيانات التصوير المقطعي المحوسب بمجال رؤية 12 سم × 12 سم × 10 سم ومصفوفة 600 × 600 × 500 فوكسل ، واحفظها كملف DICOM.

3. الفحص على نطاق واسع

  1. نضح الضغط والتثبيت
    ملاحظة: يقوم المؤلفون بتعديل تقنيات التروية والتثبيت بالضغط الموصوفة سابقا وتطبيقها على قلوب البشر غير الفاشلة المرفوضة للزرع14،19،20،21.
    1. استخدم مضخات عالية التدفق لتثبيت التروية. استخدم إما 100٪ إيثانول14 أو 4٪ PFA أو 10٪ فورمالين للمثبت.
      ملاحظة: يتم استرداد القلب مع الشريان الأورطي الصاعد والجذع الرئوي وكل من الوريد الأجوف والأوردة الرئوية التي يتم استئصالها على أبعد مسافة ممكنة ويتم تسليمها في محلول جامعة ويسكونسن23.
    2. استخدم قنيتين جراحيتين 20-24 Fr لنضح القلب الأيمن والأيسر. بالنسبة لتروية القلب الأيمن ، قم بتقليب الوريد الأجوف العلوي ، وضع فتحة تهوية في الجذع الرئوي أو الشريان الرئوي باستخدام محاقن بلاستيكية نصف مقطوعة بحجم 12-30 مل مع أطراف Luer-Lock متصلة بمحبس ثلاثي الاتجاهات.
    3. انسداد الوريد الأجوف السفلي والشريان الرئوي الآخر بخيوط بعد وضع حقنة بلاستيكية نصف مقطوعة مقفلة بحجم مناسب أو أنبوب طرد مركزي 1.5-5.0 مل.
      1. من أجل التروية المسبقة للقلب الأيسر ، قم بتقليب أحد الأوردة الرئوية ووضع فتحة تهوية في الطرف المقطوع البعيد من الشريان الأورطي باستخدام محاقن بلاستيكية نصف مقطوعة بحجم 12-30 مل مع أطراف Luer-Lock متصلة بمحبس ثلاثي الاتجاهات.
      2. للتروية الرجعية للقلب الأيسر، قم بتقليب أحد فروع قوس الأبهر ووضع فتحة تهوية في فرع آخر من قوس الأبهر. ضع أطراف القنية في كلا البطينين.
    4. قم بسد فتحات الأوعية الأخرى بخيوط بعد إدخال حقنة بلاستيكية نصف مقطوعة مقفلة بحجم مناسب أو أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5-5.0 مل. استخدم شاشا رفيعا لتغطية الجزء المدخل من المحاقن / الأنابيب / القنية لمنع التسرب والانزلاق. قم بإصلاح التسريبات الكبيرة باستخدام الخياطة أو الربط أو التكتل. التسريبات الصغيرة مسموح بها.
    5. تعليق القلب في وعاء بلاستيكي.
    6. قم بتوصيل أنابيب بلاستيكية ناعمة 22-24 Fr بكل قنية وأدخل الطرف الآخر من الأنبوب في الحاوية المملوءة بالمثبت.
    7. قم بتدوير المثبت عبر دوائر القلب الأيمن والأيسر باستخدام مضخة عالية التدفق مضبوطة على حوالي 100-300 مل / دقيقة للقلب الأيمن و 200-400 مل / دقيقة للقلب الأيسر لتحقيق ما يقرب من 20 مم زئبق في البطين الأيمن و 80 مم زئبق في البطين الأيسر ، على التوالي.
    8. الحفاظ على التروية عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
    9. اغسل القلب ب 0.01 مول / لتر PBS لمدة 30 دقيقة مع التحريك أربع مرات.
    10. يخزن القلب في 0.01 مول/لتر PBS/0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تثبيت التروية بالضغط فعال فقط لقلب جديد ، وليس للقلب الذي تم استرداده من جثة محنطة.
  2. تشريح الإجمالي
    1. أداء تشريح تدريجي مع التسجيلات الفوتوغرافية في كل مرحلة من مراحل التشريح.
    2. للحفاظ على الأهمية السريرية ، انتبه بشكل خاص لتجنب تشويه / تشويه أي هياكل للحفاظ على التشكل الفسيولوجي للقلب.
    3. هياكل هدف الصورة باستخدام الاتجاه ذي الصلة سريريا ، مثل الاتجاه المائل الأمامي الأيمن.
  3. تصوير
    1. ضع القلب الثابت والثابت بالضغط على حامل ثلاثي القوائم مع منصة مثبتة بشوكات متعددة والقدرة على تدوير 360درجة.
    2. قم بتصوير القلب باستخدام كاميرا رقمية عاكسة أحادية العدسة (الشكل 5)24 أثناء استخدام العديد من لوحات ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء الموضوعة على C-Stands وقطعة قماش خلفية سوداء عريضة.
    3. التقط الصور باستخدام العدسة ذات البعد البؤري الطويل (200 مم) لمسافة عمل من 4-6 أقدام لتقليل تشوه الهدف14.
  4. النقش
    1. لعرض الصور النقشية ، أعد بناء زوج من الصور الفوتوغرافية أو الصور المعروضة بحجم من مجموعات بيانات التصوير المقطعي المحوسب بفارق 10 درجات في زاوية الدوران على المستوى الأفقي.
    2. قم بتحويل مجموعة من هذه الصور ثنائية الأبعاد (2D) ، المشار إليها باسم صورة مجسمة ، إلى نقش باستخدام برنامج مجاني16.
    3. لعرض النقش ، استخدم نظارات حمراء / سماوية.
  5. المسح التصويري
    ملاحظة: المسح التصويري هو العلم التطبيقي لتوليد إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من صور متعددة ثنائية الأبعاد تم التقاطها بزوايا مختلفة17.
    1. العينة على C-Stand أو ضعها على طاولة الدوران للحصول على مئات الصور متعددة الاتجاهات باستخدام هاتف ذكي.
    2. إنشاء نموذج 3D بتنسيق FBX باستخدام البرامج المتاحة تجاريا.
  6. التصوير المقطعي المحوسب
    ملاحظة: يمكن إجراء التصوير المقطعي المحوسب بعد التروية بالضغط والتثبيت وفي أي مرحلة من مراحل التشريح.
    1. عينة القلب من قضيب يوضع أعلى الحاوية. لمنع القلب من التأرجح أثناء الفحص ، ادعم قاعدة القلب بشوكات بلاستيكية مثبتة في الجزء السفلي من الحاوية. وبالتالي ، فإن الهواء سيكون بمثابة تباين سلبي.
    2. قم بإجراء الفحص بالأشعة المقطعية باستخدام ماسح ضوئي بالأشعة المقطعية متعدد الكاشفات متوفر تجاريا مع المعلمات التالية: جهد الأنبوب 120 كيلو فولت ، تيار الأنبوب 800-900 مللي أمبير ، ودوران جسري يبلغ 280 مللي ثانية. يبلغ طول الجرعة بشكل عام 500-1200 mGy.cm.
    3. إعادة بناء بيانات الصورة المحورية باستخدام المعلمات التالية: سمك المقطع ، 0.6 مم ؛ فاصل زمني تزايدي ، 0.3 مم ؛ مجال رؤية ، صغير قدر الإمكان (بشكل عام 100-200 مم) ؛ ومصفوفة ، 512 × 512.
  7. تشريح الظاهري
    1. تحليل صور التصوير المقطعي المحوسب باستخدام البرامج المتاحة تجاريا لإنشاء صور تشريح افتراضية.
      ملاحظة: التشريح الافتراضي هو تعديل لعملية عرض الحجم حيث يتم تحويل التركيز إلى جدران غرف القلب والأوعية18. في هذه العملية ، يزيل الحد الأدنى اليدوي فعليا الغرفة المحسنة من مجموعات البيانات الأصلية.
    2. تصور الجدران غير المحسنة والحاجز والصمامات مع تشريح افتراضي لإنتاج صور مشابهة للتشريح الإجمالي. على عكس التشريح الإجمالي لعينات القلب ، فإن الطائرات المقطوعة أثناء التشريح الافتراضي غير محدودة عمليا. يمكن إعادة إنشاء أي طريقة عرض تقريبا لتصور هياكل الاهتمام حسب الحاجة.
  8. الطباعة 3D
    1. افتح الملف المتوافق لعينة القلب في برنامج طابعة 3D.
    2. استخدم ملف تعريف Quick DETAIL مقاس 0.10 مم لإعدادات الطباعة في الطابعة ثلاثية الأبعاد وقم بتقليل سرعة الطباعة إلى 20 مم / ثانية. تمكين إنشاء مواد الدعم.
    3. استخدم ملف تعريف خيوط TPU ل "إعدادات الفتيل" في طابعة 3D.
    4. استخدم ملف تعريف فوهة Prusa MK4 Input Shaper 0.4 الأصلية من أجل "إعدادات الطابعة" في الطابعة.
    5. بعد اكتمال التقطيع ، احفظ ملف BGCODE في محرك أقراص فلاش USB للطباعة ثلاثية الأبعاد.
    6. استخدم خيوط TPU مقاس 1.75 مم لطباعة عينة قلب الإنسان ثلاثية الأبعاد. قبل الطباعة ثلاثية الأبعاد ، جفف خيوط TPU لمدة 6 ساعات باستخدام مجفف خيوط.
    7. لتقليل توتر الفتيل أثناء الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ، ضع بكرة الفتيل على حامل بكرة مع محمل مدمج لتسهيل دوران بكرة الفتيل. قم بإجراء الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد متوفرة تجاريا مع صفائح فولاذية مطلية بالمسحوق.
    8. قم بإزالة مواد الدعم بعناية عند اكتمال الطباعة ثلاثية الأبعاد.

النتائج

الفحوصات المجهرية
تطبيق تطهير الأنسجة يسمح بتصوير كميات أكبر من الأنسجة في 3D باستخدام المجهر متحد البؤر. في القلب ، يمكن تصور العقد التي تحتوي على الخلايا العصبية القلبية والنمط العصبي لتعصيب عضلة القلب (الشكل 2). يوضح الشكل 3 صورة متحدة البؤر لعض...

Discussion

توضح هذه الدراسة خط الأنابيب الشامل لتحليل العينات التي تم الحصول عليها من قلوب بشرية كاملة. تظهر النتائج التمثيلية فحوصات تشريحية صغيرة إلى كبيرة يتم إجراؤها بشكل روتيني لقلب واحد. نظرا لأن عينة قلب الإنسان ثمينة للغاية ، فإن النهج متعدد المقاييس مثالي وفعال حتى لا تضيع أي أجزاء من العين...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

نشكر الأفراد الذين تبرعوا بأجسادهم للنهوض بالتعليم والبحث. نحن ممتنون لمؤسسة OneLegacy ، التي شكلت الأساس للحصول على قلوب المانحين للبحث. نحن ممتنون أيضا لأنتوني أ. سميثسون وأرفين روكي فيرديفلور من مركز التصوير البحثي الانتقالي بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (قسم الأشعة) لدعمهم في الحصول على بيانات التصوير المقطعي المحوسب. تم دعم هذا المشروع من قبل مشروع عمارة ياد بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. نحن ممتنون للدكتورين كاليانام شيفكومار وأولوجيمي أ. أجيجولا لإنشاء وصيانة خط أنابيب القلب البشري للبحث. نحن نقدر مديرة عمليات البحث لدينا ، أميكشا س. غاندي لتفانيها في دعم مشاريعنا. أصبح هذا العمل ممكنا بفضل دعم منح المعاهد الوطنية للصحة OT2OD023848 و P01 HL164311 ومنحة Leducq 23CVD04 إلى Kalyanam Shivkumar ، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 23CDA1039446 إلى PH ، ومشروع UCLA Amara-Yad (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). تم تمويل الماسح الضوئي GNEXT microPET / CT المستخدم في هذه الدراسة من قبل NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x Phosphate buffered salineSigma-AldrichP3813
3D ViewerMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lensNikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibodySigma-AldrichC6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)Abcamab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)Synaptic Systems139 103
Benzyl etherSigma-Aldrich108014
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mmNinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DichloromethaneSigma-Aldrich270997-100ML
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418-500ML
Ethanol, 100%Decon laboratories2701
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Imaging softwareZeissZEN (black edition)
Imaging softwareOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic PumpLONGER
Lightview XL Brightech
Methanol (Certified ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 3D printerPrusa Research
PAP penAbcamab2601
Paraformaldehyde, 32%Electron Microscopy Sciences15714-S
PolycamPolycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Sodium azide, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerFree ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, PrecleanedFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN

References

  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188 (2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636 (2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944 (2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937 (2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30 (2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850 (2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved