A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

للتحقيق في الاستجابة المناعية لاضطرابات الدماغ ، يتمثل أحد الأساليب الشائعة في تحليل التغيرات في الخلايا المناعية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين بسيطين وفعالين لعزل الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران ونخاع عظم الجمجمة.

Abstract

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الاستجابة المناعية التي تسببها اضطرابات الدماغ (على سبيل المثال ، نقص تروية الدماغ والتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي) لا تحدث فقط في الدماغ ، ولكن أيضا في الجمجمة. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية نحو تحليل التغيرات في مجموعات الخلايا المناعية في كل من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة بعد تلف الدماغ (مثل السكتة الدماغية) في الحصول على أعداد كافية من الخلايا المناعية عالية الجودة للتحليلات النهائية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين محسنين لعزل الخلايا المناعية من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. تنعكس مزايا كلا البروتوكولين في بساطتهما وسرعتهما وفعاليتهما في إنتاج كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة. قد تكون هذه الخلايا مناسبة لمجموعة من التطبيقات النهائية ، مثل فرز الخلايا وقياس التدفق الخلوي والتحليل النسخي. لإثبات فعالية البروتوكولات ، تم إجراء تجارب التنميط المناعي على أدمغة السكتة الدماغية ونخاع عظم الجمجمة الطبيعي في الدماغ باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ، وتتماشى النتائج مع نتائج الدراسات المنشورة.

Introduction

الدماغ ، المحور المركزي للجهاز العصبي ، محمي بواسطة الجمجمة. تحت الجمجمة توجد ثلاث طبقات من النسيج الضام تعرف باسم السحايا - الأم الجافية ، الأم العنكبوتية ، والأم الحنان. يدور السائل الدماغي الشوكي (CSF) في الفضاء تحت العنكبوتية بين الأم العنكبوتية والأم الحنون ، مما يخفف من الدماغ ويزيل النفايات أيضا عبر الجهاز اللمفاوي 1,2. توفر هذه البنية الفريدة معا بيئة آمنة وداعمة تحافظ على استقرار الدماغ وتحميه من الإصابة المحتملة.

لطالما اعتبر الدماغ متميزا في المناعة. ومع ذلك ، فقد تم التخلي عن هذه الفكرة جزئيا حيث تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة ....

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام في معهد ديوك (IACUC). تم استخدام ذكور C57Bl / 6 الفئران (3-4 أشهر ؛ 22-28 جم) في الدراسة الحالية. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تعليق خلية واحدة من دماغ الفأر

ملاحظة: يوضح الشكل 1 نظرة عامة على بروتوكول عزل خلايا الدماغ.

  1. تخدير الفأر وتنبيبه وتأمينه ، كما هو موضح سابقا11.
  2. قم بعمل شق في الجزء العلوي من البطن عبر الجلد وطبقات العضلات الأساسية ، وقم بقص الحجاب الحاجز والأضلاع بعناية لإنشاء فتحة في التجويف الصدري.
  3. امل....

النتائج

لتحضير الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفأر ، ينتج البروتوكول عموما خلايا ذات قابلية عالية للحياة (84.1٪ ± 2.3٪ [متوسط ± SD]). ما يقرب من 70 ٪ -80 ٪ من هذه الخلايا هي CD45 إيجابية. في دماغ الفأر الطبيعي ، تكون جميع خلايا CD45 + تقريبا عبارة عن خلايا دبقية صغيرة (CD45LowCD11b +) ، كما هو متوقع. تم .......

Discussion

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين بسيطين لكنهما فعالان لعزل الخلايا المناعية عن الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. يمكن أن تنتج هذه البروتوكولات بشكل موثوق كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة التي قد تكون مناسبة لتطبيقات المصب المتنوعة ، ولا سيما لقياس التدفق الخلوي.

لدراسة الا.......

Disclosures

اي.

Acknowledgements

نشكر كاثي غيج على مساهمتها التحريرية الممتازة. تم إنشاء الأشكال التوضيحية باستخدام BioRender.com. تم دعم هذه الدراسة بأموال من قسم التخدير (المركز الطبي بجامعة ديوك) ومنح المعاهد الوطنية للصحة NS099590 و HL157354 و NS127163.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-068
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide NeedleBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339653
96-well V-bottom microplate SARSTEDT82.1583
AURORA  flow cytometerCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 dilution
CD19-BV785BioLegend1155431:500 dilution
CD19-FITCBioLegend1155061:500 dilution
CD3-APCBioLegend1003121:500 dilution
CD3-PEBioLegend1002061:500 dilution
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 dilution
CD45-BV421Biolegend1031331:500 dilution
Cell Strainer 70 umAvantor732-2758
Dressing Forceps V. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 dilution
ForcepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificN71671:500 dilution
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 dilution
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 dilution
Percoll (density gradient medium)Cytiva17089101
Phosphate buffer saline (10x)Gibco70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)BioLegend420302
ScissorsSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL SizeDWK Life Sciences357544

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved