عزل الخلايا المناعية عن دماغ الفأر والجمجمة

Summary

للتحقيق في الاستجابة المناعية لاضطرابات الدماغ ، يتمثل أحد الأساليب الشائعة في تحليل التغيرات في الخلايا المناعية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين بسيطين وفعالين لعزل الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران ونخاع عظم الجمجمة.

Abstract

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الاستجابة المناعية التي تسببها اضطرابات الدماغ (على سبيل المثال ، نقص تروية الدماغ والتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي) لا تحدث فقط في الدماغ ، ولكن أيضا في الجمجمة. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية نحو تحليل التغيرات في مجموعات الخلايا المناعية في كل من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة بعد تلف الدماغ (مثل السكتة الدماغية) في الحصول على أعداد كافية من الخلايا المناعية عالية الجودة للتحليلات النهائية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين محسنين لعزل الخلايا المناعية من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. تنعكس مزايا كلا البروتوكولين في بساطتهما وسرعتهما وفعاليتهما في إنتاج كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة. قد تكون هذه الخلايا مناسبة لمجموعة من التطبيقات النهائية ، مثل فرز الخلايا وقياس التدفق الخلوي والتحليل النسخي. لإثبات فعالية البروتوكولات ، تم إجراء تجارب التنميط المناعي على أدمغة السكتة الدماغية ونخاع عظم الجمجمة الطبيعي في الدماغ باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ، وتتماشى النتائج مع نتائج الدراسات المنشورة.

Introduction

الدماغ ، المحور المركزي للجهاز العصبي ، محمي بواسطة الجمجمة. تحت الجمجمة توجد ثلاث طبقات من النسيج الضام تعرف باسم السحايا - الأم الجافية ، الأم العنكبوتية ، والأم الحنان. يدور السائل الدماغي الشوكي (CSF) في الفضاء تحت العنكبوتية بين الأم العنكبوتية والأم الحنون ، مما يخفف من الدماغ ويزيل النفايات أيضا عبر الجهاز اللمفاوي ^1,2. توفر هذه البنية الفريدة معا بيئة آمنة وداعمة تحافظ على استقرار الدماغ وتحميه من الإصابة المحتملة.

لطالما اعتبر الدماغ متميزا في المناعة. ومع ذلك ، فقد تم التخلي عن هذه الفكرة جزئيا حيث تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة ....

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام في معهد ديوك (IACUC). تم استخدام ذكور C57Bl / 6 الفئران (3-4 أشهر ؛ 22-28 جم) في الدراسة الحالية. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تعليق خلية واحدة من دماغ الفأر

ملاحظة: يوضح الشكل 1 نظرة عامة على بروتوكول عزل خلايا الدماغ.

1. تخدير الفأر وتنبيبه وتأمينه ، كما هو موضح سابقا¹¹.
2. قم بعمل شق في الجزء العلوي من البطن عبر الجلد وطبقات العضلات الأساسية ، وقم بقص الحجاب الحاجز والأضلاع بعناية لإنشاء فتحة في التجويف الصدري.
3. امل....

النتائج

لتحضير الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفأر ، ينتج البروتوكول عموما خلايا ذات قابلية عالية للحياة (84.1٪ ± 2.3٪ [متوسط ± SD]). ما يقرب من 70 ٪ -80 ٪ من هذه الخلايا هي CD45 إيجابية. في دماغ الفأر الطبيعي ، تكون جميع خلايا CD45 ⁺ تقريبا عبارة عن خلايا دبقية صغيرة (CD45^LowCD11b ⁺) ، كما هو متوقع. تم .......

Discussion

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين بسيطين لكنهما فعالان لعزل الخلايا المناعية عن الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. يمكن أن تنتج هذه البروتوكولات بشكل موثوق كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة التي قد تكون مناسبة لتطبيقات المصب المتنوعة ، ولا سيما لقياس التدفق الخلوي.

لدراسة الا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544