مقايسة إعادة تجميع لوسيفيراز سبليت لقياس ملامسات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الحية

Summary

لقد أنشأنا مقايسة إعادة تجميع لوسيفيراز سبليت لمراقبة ملامسات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الحية. باستخدام هذا الاختبار ، نصف بروتوكولا لقياس مستوى هذه الاقتران بين العضيات في الخلايا HEK293T ، كاما ، في حالة المعالجة الكيميائية.

Abstract

تلعب مواقع التلامس بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا دورا مهما في صحة الخلايا والتوازن ، مثل تنظيم Ca²⁺ والتوازن الدهني ، وديناميكيات الميتوكوندريا ، والتكوين الحيوي للجسيم الذاتي والانقسام المبرمج. الفشل في الحفاظ على اقتران ER الطبيعي والميتوكوندريا متورط في العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري والشلل النصفي التشنجي الوراثي. من الأهمية بمكان استكشاف كيف يمكن أن يؤدي عدم تنظيم ملامسات الميتوكوندريا ER إلى موت الخلايا وما إذا كان إصلاح هذه الاتصالات إلى المستوى الطبيعي يمكن أن يحسن من الظروف التنكسية العصبية. وبالتالي ، فإن المقايسات المحسنة التي تقيس مستوى هذه الاتصالات يمكن أن تساعد في إلقاء الضوء على الآليات المسببة للأمراض لهذه الأمراض. في النهاية ، سيسهل إنشاء فحوصات بسيطة وموثوقة تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. نصف هنا مقايسة سبليت لوسيفيراز لقياس مستوى ملامسات الميتوكوندريا ER في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الاختبار لدراسة الدور الفيزيولوجي المرضي لهذه جهات الاتصال وكذلك لتحديد معدلات الفحص عالي الإنتاجية.

Introduction

تعتبر التفاعلات بين ER والميتوكوندريا أمرا حيويا للتوازن الخلوي والبقاء^{على قيد الحياة 1،2،3،4}. تشير الأدلة السابقة إلى أن أي نوع من الاضطراب أو عدم التنظيم في مواقع الاتصال بالميتوكوندريا ER يمكن أن يساهم في العديد من الأمراض التنكسية العصبية والتمثيل الغذائي والقلب والأوعية الدموية ، بالإضافة إلى السرطان^{5،6،7،8،9،10}

Protocol

1. صيانة الخلايا والبذر (اليوم 1)

1. الحفاظ على خلايا HEK293T في وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل بقري جنين 10٪ (في أطباق استزراع 100 مم) في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. قبل البدء ، تحقق من التقاء اللوحة من خلال المشاهدة تحت المجهر. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80-90٪ من التقاء ، استعد لزرع الخلايا في صفيحة مزرعة مكونة من 6 آبار عن طريق إزالة الوسائط وغسلها ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
3. قم بإزالة DPBS من طبق المزرعة وعالج الخلايا ب 1 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA الفينول الأحمر. احتضن ل....

النتائج

لقد استخدمنا البروتوكول الموصوف أعلاه لقياس مستوى اتصالات الميتوكوندريا ER عند إضافة ثلاثة مركبات معروفة بتثبيط GTPases المحددة. CDC42 و RHO و RAC هي GTPases التي تعزز بلمرة الأكتين²⁸ عند تنشيطها ويتم تثبيطها بواسطة ZCL278 و Rhosin و Ehop-016 ، على التوالي²⁴. تم التعامل.......

Discussion

لقد استخدمنا مقايسة إعادة تجميع Renilla luciferase 8 (مقايسة Split-Rluc) لتحديد مستوى وصلات ER-mitochondria. في هذه الدراسة ، قمنا بتعديل بناء split-Rluc^{الأصلي 24} عن طريق إنشاء متجه واحد ، pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry ، وترميز كل مكون من مكونات Split-Rluc .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C