تطوير العلاجات التوافقية لإصابة الحبل الشوكي باستخدام توصيل الخلايا الجذعية

Inha Baek; Younghye Song

doi:10.3791/66872

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

في هذه الدراسة ، تم تطوير الهلاميات المائية المركبة المضادة للأعصاب ووصفها والتي يمكن استخدامها للتحقيق والاستفادة من السلوك المؤيد للتجدد للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لإصلاح إصابات الحبل الشوكي.

Abstract

تؤدي إصابة الحبل الشوكي الرضحية (SCI) إلى حدوث عجز حسي حركي دائم أسفل موقع الإصابة. إنه يؤثر على ما يقرب من ربع مليون شخص في الولايات المتحدة ، ويمثل مصدر قلق لا يقاس للصحة العامة. تم إجراء البحوث لتوفير العلاج الفعال. ومع ذلك ، لا يزال اصابات النخاع الشوكي تعتبر غير قابلة للشفاء بسبب الطبيعة المعقدة لموقع الإصابة. يتم التحقيق في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات ، بما في ذلك توصيل الأدوية وزرع الخلايا والمواد الحيوية القابلة للحقن ، لكن استراتيجية واحدة وحدها تحد من فعاليتها في التجديد. على هذا النحو ، اكتسبت العلاجات التوافقية مؤخرا اهتماما يمكن أن تستهدف السمات متعددة الأوجه للإصابة. لقد ثبت أن المصفوفات خارج الخلية (ECM) قد تزيد من فعالية زرع الخلايا من أجل اصابات النخاع الشوكي. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد التي تتكون من الحبال الشوكية منزوعة الخلايا (dSCs) والأعصاب الوركي (dSNs) بنسب مختلفة وتميزها. أكد التحليل النسيجي ل dSCs و dSNs إزالة المكونات الخلوية والنووية ، وتم الاحتفاظ ببنى الأنسجة الأصلية بعد إزالة الخلايا. بعد ذلك ، تم إنشاء الهلاميات المائية المركبة بنسب حجمية مختلفة وإخضاعها لتحليلات حركية هلام التعكر ، والخصائص الميكانيكية ، وقابلية الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hASC) المضمنة. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في الخصائص الميكانيكية بين النسب المختلفة للهلاميات المائية ومصفوفات الحبل الشوكي منزوعة الخلايا. ظلت ASCs البشرية المضمنة في المواد الهلامية قابلة للحياة طوال ثقافة 14 يوما. توفر هذه الدراسة وسيلة لتوليد الهلاميات المائية الاندماجية المصممة بالأنسجة والتي تقدم ECM الخاصة بالأعصاب والخلايا الجذعية الوسيطة المؤيدة للتجديد. يمكن أن توفر هذه المنصة رؤى جديدة حول استراتيجيات التجدد العصبي بعد اصابات النخاع الشوكي مع التحقيقات المستقبلية.

Introduction

يعاني ما يقرب من 296,000 شخص من اصابات النخاع الشوكي المؤلمة ، وكل عام هناك حوالي 18,000 حالة جديدة من اصابات النخاع الشوكي تحدث في الولايات المتحدة ^{الأمريكية.1}. عادة ما يحدث اصابات النخاع الشوكي المؤلمة بسبب السقوط والجروح الناجمة عن طلقات نارية وحوادث المركبات والأنشطة الرياضية وغالبا ما يسبب فقدانا دائما للوظيفة الحسية الحركية أسفل موقع الإصابة. تتراوح النفقات المقدرة مدى الحياة لعلاج اصابات النخاع الشوكي بين مليون إلى خمسة ملايين دولار لكل فرد مع انخفاض كبير في متوسط العمر^{المتوقع 1}. ومع ذلك ، لا يزال اصابات النخاع الشوكي غير مفهومة جيدا وغير قابلة للشفاء إلى حد كبير ، ويرجع ذلك أساسا إلى العواقب الفيزيولوجية المرضية المعقدة بعد الإصابة². تم التحقيق في استراتيجيات مختلفة ، بما في ذلك زرع الخلايا والسقالات القائمة على المواد الحيوية. في حين أن زرع الخلايا والمواد الحيوية قد أظهر إمكاناته ، فإن الطبيعة متعددة الأوجه لمرض اصابات النخاع الشوكي تشير إلى أن الأساليب التوافقية قد تكون أكثر فائدة³. نتيجة لذلك ، تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات التوافقية وأظهرت فعالية علاجية أفضل من المكونات الفردية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوفير مواد حيوية جديدة لتوصيل الخلايا والأدوية³.

أحد الأساليب الواعدة لتصنيع الهلاميات المائية الطبيعية هو إزالة الخلايا الأنسجة. تستخدم عملية إزالة الخلايا طرقا أيونية وغير أيونية وفيزيائية وتوافقية لإزالة جميع أو معظم المواد الخلوية والنووية مع الحفاظ على مكونات ECM. عن طريق إزالة جميع أو معظم المكونات الخلوية ، تكون الهلاميات المائية المشتقة من ECM أقل تفاعلا مناعيا للمضيف بعد الزرع / الحقن⁴. هناك العديد من المعلمات التي يجب قياسها من أجل تقييم جودة الأنسجة منزوعة الخلايا: إزالة المحتويات الخلوية / النووية ، والخصائص الميكانيكية ، والحفاظ على ECM. تم وضع المعايير التالية لتجنب الاستجابات المناعية الضارة: 1) أقل من 50 نانوغرام من الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) لكل مجم من الوزن الجاف ECM ، 2) أقل من 200 نقطة أساس طول جزء الحمض النووي ، و 3) تقريبا أو معدومة مادة نووية مرئية ملطخة ب 4'6-diamidino-2-phenuylindole (DAPI) ⁵. يمكن قياس الخواص الميكانيكية عن طريق اختبارات الشد والضغط و / أو الريولوجيا ، ويجب أن تكون مشابهة للأنسجة^{الأصلية 6}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم الحفاظ على البروتين عن طريق البروتينات أو المقايسات الكمية التي تركز على المكونات الرئيسية للأنسجة منزوعة الخلايا ، على سبيل المثال ، اللامينين ، الجليكوزامينوجليكان (GAG) ، وكبريتات شوندروتن بروتيوغليكان (CSPG) للحبل الشوكي⁷^،⁸. يمكن إعادة الخلايا الهلامية المائية المشتقة من ECM التي تم التحقق منها بأنواع مختلفة من الخلايا للمساعدة في العلاج القائم على الخلايا⁹.

تمت دراسة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، مثل خلايا شوان ، وخلايا التغليف الشمي ، والخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام (MSCs) ، والخلايا الجذعية / السلفية العصبية ، لإصلاح اصابات النخاع^{الشوكي 10}^،¹¹^،¹². ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لهذه الخلايا محدود بسبب المخاوف الأخلاقية ، والتكامل المتناثر مع الخلايا / الأنسجة المجاورة ، ونقص مصادر الأنسجة للحصول على عائد مرتفع ، وعدم القدرة على التجديد الذاتي ، و / أو القدرة التكاثرية^{المحدودة 13}^،¹⁴^،¹⁵. على عكس هذه الأنواع من الخلايا ، تعتبر الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hASCs) مرشحا جذابا لأنه يمكن عزلها بسهولة بطريقة طفيفة التوغل باستخدام الخلايا الدهنية ، ويمكن الحصول على عدد كبير من الخلايا¹⁶. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع hASCs بالقدرة على إفراز عوامل النمو والسيتوكينات التي لديها القدرة على الحماية العصبية ، وعلم الأوعية الدموية ، والتئام الجروح ، وتجديد الأنسجة ، وتثبيط المناعة¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹.

كما تم وصفه ، تم إجراء دراسات متعددة²²^،²³^،²⁴ ، وتم تعلم الكثير منها ، لكن الخصائص غير المتجانسة لمرض اصابات النخاع الشوكي حدت من فعاليتها في تعزيز التعافي الوظيفي. على هذا النحو ، تم اقتراح مناهج اندماجية لزيادة فعالية علاج اصابات النخاع الشوكي. في هذه الدراسة ، تم تطوير الهلاميات المائية المركبة من خلال الجمع بين الحبال الشوكية منزوعة الخلايا والأعصاب الوركي لثقافة hASC ثلاثية الأبعاد (3D). تم تأكيد إزالة الخلايا الناجحة من خلال التحليلات النسيجية والحمض النووي ، وتم تمييز نسب مختلفة من الهلاميات المائية المركبة للأعصاب من خلال حركية الهلام الهلامي واختبارات الضغط. تم التحقيق في جدوى hASCs في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب لإثبات أنه يمكن استخدام هذا الهيدروجيل كمنصة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

Protocol

تم الحصول على أنسجة الخنازير تجاريا ، لذلك لم تكن موافقة لجنة أخلاقيات مطلوبة.

1. نزع خلايا الحبل الشوكي الخنازير (الوقت المقدر: 5 أيام)

ملاحظة: قم بإجراء إزالة الخلايا باستخدام البروتوكولات المحددة مسبقا مع التعديلات²⁵^،²⁶. يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة سلامة حيوية معقمة في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب تصفية جميع المحاليل معقمة باستخدام مرشح أعلى الزجاجة (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) في زجاجات معقمة يمكن إجراء الإجراءات التي سيتم تنفيذها عند 37 درجة مئوية داخل حاضنة أو فرن نظيف مضبوطة على 37 درجة مئوية.

تحضير حلول إزالة الخلايا
ملاحظة: يتم حساب جميع الحلول بسعة 1 لتر. قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط الحجم النهائي المطلوب وفقا لاحتياجاتهم التجريبية.
1. خفف 500 مل من 0.05٪ تريبسين / حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) مع 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لصنع 0.025٪ تريبسين / EDTA.
2. خفف 300 مل من 10٪ Triton X-100 مع 700 مل من PBS لصنع 3٪ Triton X-100. امزج 0.56 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.31 جم من NaH₂PO₄H₂O ، و 10.85 جم من_{HNa 2}O₄P·7H₂O في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل 100 ملي مولار Na / 50 ملي مولار فوس.
3. امزج 32.4 جم من السكروز في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل 1 متر من السكروز. امزج 40 جم من ديوكسي كولات الصوديوم (SD) في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل محلول SD بنسبة 4٪. خفف 6.7 مل من حمض البيراسيتيك 15٪ مع 993.3 مل من الإيثانول 4٪.
تحضير الحبل الشوكي الخنازير
ملاحظة: تم شحن الحبال الشوكية مجمدة دون أي محلول وحفظها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
1. قم بإذابة الحبل الشوكي عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 18-24 ساعة قبل إزالة الخلايا. استخدم مقصا معقما لإزالة الأم الجافية بعناية.
2. قطع الحبل الشوكي إلى قطع صغيرة (طولها حوالي 1 سم). ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل أو ثلاث قطع كحد أقصى في أنبوب سعة 50 مل.
نزع خلايا الحبل الشوكي
ملاحظة: بعد كل خطوة ، يتم سكب محاليل إزالة الخلايا يدويا في دورق كبير للتخلص منه. يمكن استخدام مصفاة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة للتعقيم للمساعدة في التخلص من محاليل إزالة الخلايا دون فقدان الأنسجة اللازمة لكل خطوة. تم تحريك الحبل الشوكي عند 83 دورة في الدقيقة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 18-24 ساعة عند 4 درجات مئوية و 60 دورة في الدقيقة.
2. اشطف الحبل الشوكي بنسبة 0.025٪ تريبسين / EDTA لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 15 دقيقة ، 2x.
3. اشطف الحبل الشوكي ب 3٪ Triton X-100 لمدة ساعتين. اشطف الحبل الشوكي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة، 2 مرة.
4. اشطف الحبل الشوكي ب 1 م من السكروز لمدة ساعة. ثم اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة.
5. اشطف الحبل الشوكي بنسبة 4٪ SD لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اشطف الحبل الشوكي بمحلول 100 ملي Na / 50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة ، 2x.
6. شطف الحبل الشوكي مع 0.1٪ حمض بيراسيتيك في 4٪ الإيثانول لمدة 4 ساعات. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 1 ساعة.
7. اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة ، 2x. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 1 ساعة.
8. قم بتجميد الحبل الشوكي بالتجميد عند 0.01 ملي بار و -56 درجة مئوية لمدة 3 أيام واحفظه جافا حتى الاستخدام.

2. نزع خلايا العصب الوركي الخنازير (الوقت المقدر: 5 أيام)

ملاحظة: قم بإجراء إزالة الخلايا باستخدام بروتوكول²⁷ تم إنشاؤه مسبقا. يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة سلامة حيوية معقمة في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب تصفية جميع المحاليل معقمة باستخدام مرشح أعلى الزجاجة (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) في زجاجات معقمة يمكن إجراء الإجراءات التي يجب تنفيذها عند 37 درجة مئوية داخل حاضنة أو فرن نظيف مضبوطة على 37 درجة مئوية.

تحضير حلول إزالة الخلايا
ملاحظة: يتم حساب جميع الحلول بسعة 1 لتر. قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط الحجم النهائي المطلوب وفقا لاحتياجاتهم التجريبية.
1. قم بإعداد 50 ملي مولار من Na / 10 mM phos buffer عن طريق خلط 1.86 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.262 جم من d NaH₂PO₄H₂O ، و 2.17 جم من_{HNa 2}O₄P·7H₂O في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
2. قم بإعداد محلول 125 ملي مولار سلفوبيتين -10 (SB-10) عن طريق خلط 38.4 جم من SB-10 في 1 لتر من 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس.
3. تحضير محلول 3٪ SD / 0.6 ملي مولار سلفوبيتين -16 (SB-16) عن طريق خلط 30 جم من SD و 0.24 جم من SB-16 في 1 لتر من 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار من الفوس.
تحضير العصب الوركي الخنازير
ملاحظة: تم شحن الأعصاب الوركي المجمدة باستخدام PBS وحفظها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
1. قم بإذابة العصب الوركي عند 4 درجات مئوية في الثلاجة قبل 18-24 ساعة من إزالة الخلايا.
2. قطع العصب الوركي إلى قطع صغيرة (طولها حوالي 1 سم). ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل أو ثلاث قطع كحد أقصى في أنبوب سعة 50 مل.
نزع الخلايا من العصب الوركي
ملاحظة: بعد كل خطوة ، يتم سكب محاليل إزالة الخلايا يدويا في دورق كبير للتخلص منه ، ويمكن استخدام مصفاة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة للتعقيم للمساعدة في التخلص من محاليل إزالة الخلايا دون فقدان الأنسجة اللازمة لكل خطوة. تم تحريك العصب الوركي عند 15 دورة في الدقيقة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. اشطف العصب الوركي بالماء منزوع الأيونات لمدة 7 ساعات. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي ب 125 ملي مولار سلفوبيتين -10 (SB-10) في 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس عازلة لمدة 18 ساعة.
2. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي باستخدام 3٪ SD / 0.6 mM sulfobetaine -16 (SB-16) في 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس عازلة لمدة ساعتين.
3. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na / 50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة ، 3x. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي ب 125 ملي مولار SB-10 في 50 ملي مولار Na / 10 ملي فوس عازلة لمدة 7 ساعات.
4. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي باستخدام 3٪ SD / 0.6 mM SB-16 في 50 ملي مولار Na / 10 ملي فوس عازلة لمدة 1.5 ساعة.
5. اشطف العصب الوركي بمحلول 50 ملي مولار Na/10 ملي فوس لمدة 15 دقيقة، 3 أضعاف. ثم اشطف العصب الوركي ب 75 وحدة / مل من ديوكسي ريبونوكلاز (DNase) لمدة 3 ساعات دون تحريض.
6. اشطف العصب الوركي بمحلول 50 ملي مولار Na/10 ملي فوس لمدة ساعة واحدة، 3 أضعاف. ثم اشطف العصب الوركي ب 0.2 وحدة / مل من شوندروتيناز ABC لمدة 16 ساعة دون تحريض عند 37 درجة مئوية.
7. اشطف العصب الوركي باستخدام PBS لمدة 3 ساعات ، 3x. قم بتجميد العصب الوركي بالتجميد عند 0.01 ملي بار و -56 درجة مئوية لمدة 3 أيام واحفظه جافا حتى الاستخدام.

3. هضم الأنسجة منزوعة الخلايا وتصنيع الهلاميات المائية المركبة (الوقت المقدر: 4 أيام)

قم بتقطيع أو طحن الأنسجة منزوعة الخلايا إلى مسحوق باستخدام المقص أو الخالط. عقم الأدوات لتقطيع أو طحن المناديل باستخدام الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. طريقة أكسيد الإيثيلين قابلة للتطبيق أيضا.
هضم الأنسجة بشكل منفصل في محلول حمض الهيدروكلوريك 0.01 نيوتن (HCl) الذي يحتوي على 1 مجم / مل بيبسين بتركيز 15 مجم / مل. الأوزان المقدرة للحبل الشوكي منزوع الخلايا والعصب الوركي هي 50-100 مجم و 100-150 مجم لكل قطعة ، على التوالي.
ضع الشريط المغناطيسي وحرك عند 500 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 4 أيام على الأقل لتوليد محاليل بريجل.
امزج العصب الوركي والحبل الشوكي النخاعي بالنسب الحجمية التالية: 2: 1 و 1: 1 و 1: 2. اضبط الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و HCl وقم بتخفيفه إلى التركيز المطلوب باستخدام وسائط M199 و 1x PBS. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: أضف هيدروكسيد الصوديوم 1 ميكرولتر في المرة الواحدة. يمكن استخدام وسائط M199 كمؤشر للأس الهيدروجيني لأنها تتحول إلى اللون الوردي الفاتح عندما يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 ، ولكن يجب استخدام شرائط الأس الهيدروجيني لتأكيد مستوى الأس الهيدروجيني.

4. التحقق من إزالة الخلايا

تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E ؛ الوقت المقدر: 8 أيام)
ملاحظة: بعد كل خطوة شطف ، يتم سكب المحاليل يدويا في دورق كبير للتخلص منه.
1. إصلاح الحبل الشوكي الطازج ومنزوعة الخلايا والعصب الوركي في 3.7٪ الفورمالديهايد عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة. ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل.
2. إزالة الفورمالديهايد ووضع الأنسجة في 10٪ سكروز لمدة يوم واحد. قم بإزالة 10٪ من السكروز وضع المناديل في 30٪ سكروز لمدة 6 أيام.
3. املأ مادة التبريد ذات الحجم المناسب بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) في منتصف الطريق. ضع الأنسجة منزوعة الخلايا, قم بتغطيتها مع OCT, والسماح لها بامتصاص OCT لمدة 1 يوم.
4. بعد يوم واحد ، قم بتجميد الأنسجة طوال الليل عند -80 درجة مئوية. قم بتقطيع الأنسجة بالتبريد بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد.
5. اشطفها ب 1x PBS لمدة 5 دقائق ، 2x. ثم اشطفها بماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
6. وصمة عار بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة. اشطفها بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة ، 3 مرات.
7. وصمة عار بمحلول اليوزين لمدة 1 دقيقة. اشطفه بنسبة 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، 2x و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، 3x.
8. اشطفها بالزيلين لمدة دقيقة واحدة ، 2 دقيقة ، ثم 1 دقيقة. دع الشرائح تجف لمدة 5 دقائق.
9. استخدم قطعة قطن لتقطير 3-4 قطرات من محلول ثنائي بوتيل فثاليت البوليسترين زيلين (DPX) على الشرائح. ضع أغطية فوق الشرائح المغطاة ب DPX. دع الشرائح تجف طوال الليل.
تحليل الحمض النووي (الوقت المقدر: 1 ساعة)
1. وزن الأنسجة منزوعة الخلايا والمجففة. عزل الحمض النووي وتحديده باستخدام المجموعات المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. توصيف الهلاميات المائية المركبة

اختبار تعكر التبلور (الوقت المقدر: 1 ساعة)
1. ضع 100 ميكرولتر من محاليل بريجل في كل بئر من صفيحة 96 بئرا على الثلج. اقرأ الامتصاص عند 405 نانومتر كل دقيقتين لمدة 45 دقيقة باستخدام قارئ لوحة.
2. احسب الامتصاص الطبيعي باستخدام المعادلة التالية:
  (الامتصاص -_{الامتصاص الأولي}) / (_{الحد الأقصى} للامتصاص -_{الامتصاص الأولي})
3. احسب ميل المنحنى والوقت اللازم لتحقيق 50٪ و 95٪ هلام ، ر_1/2 و ر₉₅ ، على التوالي.
اختبار الضغط (الوقت المقدر: 1 دقيقة لكل هيدروجيل)
1. تصنيع هيدروجيل مركب بتركيز 12 مجم / مل بقطر 8 مم وارتفاع 2 مم.
2. استخدم مقياس الريومتر لضغط العينات بحمل 250 نيوتن بين الألواح المتوازية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بمعدل إجهاد 10٪ من ارتفاع العينة / دقيقة. سيوفر البرنامج الذي يوفر قراءات مقياس الريومتر منحنى الإجهاد والإجهاد من خلال تطبيق القوة وقياس الإجهاد حتى تنكسر الهلاميات المائية.
3. احسب معامل يونغ من ميل المنطقة الخطية لمنحنيات الإجهاد والإجهاد.

6. ثقافة ثلاثية الأبعاد ل ASCs البشرية في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب

إعداد منصة ثلاثية الأبعاد (3D) (الوقت التقريبي: 3 ساعات)
1. رقاقة السيليكون المحفورة مع مقاومة الضوء SU-8 لتوليد أنماط دائرية بعمق 200 ميكرومتر وقطر 4 مم.
2. امزج قاعدة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. يسكب المزيج على رقاقة السيليكون ويترك لمدة 20 دقيقة لإزالة جميع الفقاعات التي تنشأ من خلط قاعدة PDMS وعامل المعالجة.
3. ضعه في الفرن ومعالجته لمدة ساعتين عند 70 درجة مئوية. قم بفك قالب ورقة PDMS المعالجة وقم بإخراجها باستخدام لكمة خزعة بقطر 8 مم لصنع آبار صغيرة PDMS.
4. ضع الآبار الصغيرة في صفيحة سعة 96 بئرا وضع لوحة البئر في منظف بلازما الهواء لتعقيم الآبار الصغيرة PDMS.
5. قم بتشغيل الآبار الصغيرة PDMS مع 1٪ بولي إيثيلين (PEI) و 0.1٪ جلوتارالديهايد (GA) لمدة 10 دقائق و 20 دقيقة على التوالي. اغسل الآبار الصغيرة بالماء المقطر ، 2x.
تحضير hASCs (الوقت المقدر: 7 أيام)
1. خلايا ممر الثقافة ل 2-5 ممرات في وسائط نمو hASCs (الوسائط القاعدية hASCs المكملة بمصل الأبقار الجنينية (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (Pen-Strep)) حتى التقاء. تمرير وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
الهلاميات المائية المركبة للأعصاب المحملة ب ASC (الوقت المقدر: 2 ساعة)
1. امزج العصب الوركي والحبل الشوكي بنسبة حجمية 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 ، وقم بإعداد هيدروجيل للحبل الشوكي فقط دون خلط أي بريجل للعصب الوركي.
2. أضف وسائط M199 واضبط درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1 N و NaOH و HCl. أعد تعليق hASCs مع وسائط النمو في البرجل بكثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل.
  ملاحظة: يجب أن تكون كمية M199 وتعليق الخلية 10٪ من بريجل.
3. خفف البرجل إلى 12 مجم / مل باستخدام 1x PBS. ضع البرجل على الآبار الصغيرة واحتضنه لمدة 30 دقيقة. استزراع الهلاميات المائية المحملة ب ASC في وسائط نمو hASCs.
اختبار بقاء الخلية (الوقت المقدر: 4 ساعات في اليوم)
1. قم بإعداد حلول اختبار الجدوى باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. شفط الوسائط في الأيام 1 و 4 و 7 و 14. أضف الكاشف إلى الآبار واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
3. اقرأ التألق عند الإثارة / الانبعاث 560/590 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. احسب النسبة المئوية للفرق باستخدام المعادلة التالية:
  [(_عينة مضان -_{فلورة فارغة}) /_{مضان فارغ}] × 100

النتائج

تم تحضير الأنسجة منزوعة الخلايا باستخدام بروتوكولات تم وضعها مسبقا مع تعديلات طفيفة²⁶^،²⁷. بعد إزالة الخلايا ، والتجميد ، والهضم ، تم تصنيع الهلاميات المائية العصبية المركبة بنسب SN: SC = 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 ، والمواد الهلامية المائية للحبل الشوكي فقط...

Discussion

يعتقد على نطاق واسع أن الفيزيولوجيا المرضية لمرض اصابات النخاع الشوكي معقدة ومتعددة الأوجه. على الرغم من أن العلاجات الفردية مثل زرع الخلايا وتوصيل الأدوية والمواد الحيوية قد قدمت رؤى قيمة حول اصابات النخاع الشوكي ، إلا أن الطبيعة المعقدة لاصابات النخاع الشوكي قد تحد م...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي شيء يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة PhRMA والمعاهد الوطنية للصحة من خلال رقم الجائزة P20GM139768 و R15NS121884 الممنوحة ل YS. نود أن نشكر الدكتور كارتيك بالاتشاندران والدكتور راج راو في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة أركنساس على السماح لنا باستخدام معداتهم. أيضا ، نود أن نشكر الدكتور جين وو كيم والسيد باتريك كوتشوارا من قسم الهندسة البيولوجية والزراعية بجامعة أركنساس على توفير التدريب على مقياس الريومتر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt	Sigma-Aldrich	D4266	Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate	Sigma-Aldrich	H6883	Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagent	Fisher Scientific	DAL1100	Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	Used during sciatic nerve decellularization
Cryostat	Leica	CM1860
Deoxyribonuclase	Sigma-Aldrich	D4263	Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	VWR	BDH9296	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69506	Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium	Sigma-Aldrich	6522	Used during H&E staining
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110216	Used during H&E staining
Ethanol	VWR	89125-172
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich	G6257	Used during PDMS surface functionalization
hASC growth media	Lonza	PT-4505	Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
Hematoxylin	VWR	26041-06	Used during H&E staining
human adipose-derived stem cell	Lonza	PT-5006
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 media	Sigma-Aldrich	M0650	Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compound	Tissue-Tek	4583
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Used to digest decellularized tissues
Peracetic acid	Lab Alley	PAA1001	Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR	97062-948
Plate reader	BioTek Instruments	Synergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	181978	Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerve	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cord	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA system	Promega	E2670	Used to analyze DNA contents
Rheometer	TA Instruments	DHR 2
Rugged rotator	Glas-co	099A RD4512	Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)	VWR	BDH9286	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	VWR	BDH9298	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)	Sigma-Aldrich	415443	Used to adjust pregels solutions
SU-8	Kayaku advnaced materials	SU8-100	Used to coat silicon wafer
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW	1317318	Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062	Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotator	Thermo Fisher	88881001	Used during sciatic nerve decellularization
Xylene	VWR	MK866816	Used during H&E staining

References

National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , (2017).
Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, 120596 (2021).
Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117 (2018).
Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692 (2022).
Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18 (2012).
Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110 (2018).
Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101 (2022).
Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269 (2014).
Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762 (2023).
Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: