نموذج تحمل الوزن الخالي من التوتر لنخر العظم الناجم عن الستيرويد لرأس الفخذ في الفئران

Summary

يوضح البروتوكول بناء نموذج تدريب بسيط وفعال من حيث التكلفة لحمل الوزن للفئران لنخر العظم الناجم عن الستيرويد لرأس الفخذ باستخدام شريط علاجي مرن.

Abstract

على عكس البشر ، فإن الفئران تمشي على أربع ، في حين أن البشر ذات قدمين تقف ، ويتعرض الوركين لضغط هائل عند المشي والوقوف. في نماذج نخر رأس الفخذ الناجم عن الستيرويد للفئران ، غالبا ما تحتاج الخصائص الميكانيكية الحيوية للورك البشري تحت ضغط أعلى إلى محاكاتها. يحاول بعض العلماء محاكاة حالة ضغط الورك البشري عن طريق جعل الفئران تحمل وزنا معينا ، لكن تثبيت الجسم الحامل للوزن على الفئران أمر صعب. يمكن للفئران أن تتحرر بسهولة من الشلل ، كما أن لصق الوزن على الفئران بشريط لاصق سيؤدي إلى اختناق الفئران أو موتها من انسداد الأمعاء. استخدمت مجموعتنا البحثية شريطا علاجيا مرنا لأداء تجميد خال من التوتر للأشياء الحاملة للوزن في الفئران حتى تتمكن الفئران من التنفس بحرية وعدم الانفصال عن الشلل في ظل ظروف تحمل الوزن. بالمقارنة مع نموذج فئران نخر رأس الفخذ الناجم عن الستيرويد المعتاد ، وجدنا أن هذا التدخل الحامل للوزن يمكن أن يؤدي إلى تفاقم تطور نخر رأس الفخذ في الفئران.

Introduction

يعد إعطاء الجلوكوكورتيكويد عامل الخطر الأكثر شيوعا لنخر العظم غير الرضحي لرأس الفخذ (ONFH)¹. تشير العديد من الأدلة إلى أنه بالإضافة إلى الجلوكوكورتيكويد ، يرتبط حمل الضغط على مفصل الورك لدى المرضى أيضا بحدوث ONFH. يتم التعرف على عوامل مثل وزن الجسم وكثافة اليد العاملة البدنية كعوامل خطر ل ONFH². أظهرت دراسات سريرية متعددة وجود علاقة وثيقة بين ظروف تحميل مفصل الورك وتوقيت وحدوث استبدال المفصل^3،4،5،6. لذلك ، فإن إنشاء نموذج يعكس العلاقة بين الحمل ونخر العظم الناجم عن الستيرويد في رأس الفخذ (SONFH) أمر مهم لإجراء تحقيق شامل لهذه الحالة.

تعمل الطيور الكبيرة ذات القدمين ، مثل النعام والإيمو ، كنماذج جيدة لمحاكاة إجهاد مفصل الورك ، تشبه أحمال الساق البشرية ^7,8. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على أنواع الطيور الكبيرة يمثل تحديا ، كما أن تكاليف البحث المرتبطة بها مرتفعة. يمكن أن تظهر نماذج الفئران ذات ارتفاع ضغط الدم^{التلقائي 9،10} معدلات أعلى من ONFH ، لكن حمل ضغط المقصورة في النخاع الناتج عن ارتفاع ضغط الدم التلقائي يختلف اختلافا كبيرا عن الضغط الميكانيكي وغير مناسب لدراسة تأثير الضغط الميكانيكي على SONFH.

تستخدم نماذج الصغيرة بشكل شائع في الأبحاث حول SONFH. ومع ذلك ، فإن الزواحف رباعية الأرجل لديها إجهاد مفصل الورك السفلي ، ولا يمكن لنماذج الورك محاكاة البيئة الميكانيكية الحيوية لمفاصل الورك البشرية أثناء المشي على قدمين. نماذج تثبيت الطرف^{الواحد 11} ونماذج التفريغ الجزئي¹² شائعة ، لكن كلاهما يقلل من تحميل الأطراف. نظرا لأن البشر كائنات ذات قدمين ذات أحمال كبيرة في الأطراف السفلية أثناء الوقوف والمشي ، فإن تقليل الحمل في هذه النماذج يقلل من العلاقة بين النماذج الحيوانية والأمراض البشرية.

تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج بسيط وفعال من حيث التكلفة للتدريب على حمل الأثقال للتحقيق في تأثير التدريب على حمل الأثقال على نخر العظم الناجم عن الستيرويد في رأس الفخذ في الفئران. حاليا ، تم استخدام نماذج الفئران لدراسة نخر العظم الناجم عن الستيرويد لرأس الفخذ^13،14 ، ولكن لا يوجد حتى الآن نموذج يمكن أن يوفر تثبيتا آمنا طويل الأمد مع الحد الأدنى من اضطراب الحركة ، وهو أيضا بسيط نسبيا وغير مكلف. في هذه الدراسة ، يتم تطبيق مادة تثبيت عالية اللصق ، تعتمد التثبيت الخالي من التوتر ، والذي يحافظ على حركة الفئران ويقلل من المعاناة وحتى الموت الناجم عن التثبيت غير السليم.

Protocol

يلتزم البروتوكول بالمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة بكين للطب الصيني ، رقم البروتوكول BUCM-4-2022062001-2109. يستخدم البروتوكول فئران Sprague Dawley (SD) (SCXK (Jing) 2019-0008) ، التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع وتزن 200 جم -250 جم.

1. التدريب على التكيف

1. يبلغ نطاق بصر الفئران البيضاء عموما أقل من 60 سم¹⁵. أثناء عملية النمذجة ، ضع الفئران في أقفاص غير شفافة واحتفظ بها بعيدا قدر الإمكان عن الفئران غير النموذجية (على الأقل ، يجب أن تكون الفئران الأخرى خارج النطاق المرئي الأقصى للفئران النموذجية) لمنعها من التعرض للإجهاد المؤلم.
2. قم بتشغيل الطاقة واضبط جهاز المشي على 10 م / دقيقة بميل 0 درجة. ضع الفئران على جهاز المشي وتأكد من أن الحركات لطيفة قدر الإمكان لتجنب الإجهاد. لا تستخدم تحفيزا إضافيا. سوف تزحف الفئران بشكل طبيعي إلى الأمام لأنها ليست على دراية بالبيئة.
3. يستمر التدريب لمدة 15 دقيقة. بعد التدريب ، نظف البراز والبول الذي تركته الفئران ورش الكحول للتخلص من رائحة الحيوان. ثم قم بإعداد الجرذ التالي للتدريب.
   ملاحظة: إذا رفض الفئران المشي على جهاز المشي لمدة 5 دقائق ، فاستبعده من الدراسة.
4. استمر في التدريب التكيفي حتى^{نهاية الأسبوع الأول} .

2. قياس القدرة القصوى على تحمل الوزن في الفئران

1. قم بإعداد أنبوبي اختبار وخطاف وقفل حلقة بطول 80 سم تقريبا. ضع كرات فولاذية في أنابيب الاختبار ، مع التأكد من أن الوزن المشترك الأولي لأنابيب الاختبار والخطاف وقفل الحلقة هو 150 جم. قم بإعداد أنابيب اختبار بأوزان إجمالية مختلفة بزيادات 10 جم ، بحيث يكون الحد الأقصى للوزن 350 جم.
2. يستخدم الباحث كلتا يديه لربط الفئران باستخدام القفازات (الشكل 1). يضع باحث آخر أنبوب الاختبار على الجزء الخلفي من الفئران على بعد حوالي 1 سم من خط الوسط من الظهر. نظرا لأن هذه الخطوة لا تتطلب حركة الفئران ، فقم بإجراء التثبيت ببساطة عن طريق لف قفل الخطاف والحلقة حول الجرذ دون استخدام تدابير إضافية لتأمين الأنبوب.
3. قم بتغيير الأنبوب حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لوزن الفئران. عندما يصل الجرذ إلى أقصى قدر من الوزن ، لا يمكنه الوقوف عند حثه أو مغادرة المجريب. قلل الوزن بمقدار 10 جم للسماح للفأر بالوقوف. يمثل هذا الوزن قدرة الفئران القصوى على تحمل الوزن.

3. إعداد حمل الوزن

1. نظرا لأن التثبيت الآمن مطلوب أثناء التدريب ، قم بتأمين الأشياء باستخدام شريط علاجي مرن من 1 إلى 1.5 متر يعتمد على حجم الفئران ، والذي له التصاق قوي. استخدم الطين لضبط وزن أنابيب الاختبار لتقليل تأرجح الحمل.
2. بعد وزن وزن أنابيب الاختبار وأجسام التثبيت ، أضف كمية مناسبة من الطين إلى أنابيب الاختبار لضبطها على الوزن المستهدف. استخدم قضيب تقليب زجاجي لتوزيع الطين بالتساوي داخل أنابيب الاختبار. قد يتسبب الطين المركز في أحد طرفي أنبوب الاختبار في انفصاله بسهولة أثناء التدريب.
3. اضبط الوزن الإجمالي لأنابيب الاختبار المعدلة والطين عند 50٪ من قدرة تحمل الوزن القصوى للفئران (الشكل 1 أ). تجاوز هذا الوزن سيجعل من الصعب على الفئران إكمال التدريب. لا تقم بضبط وزن الحمل مرة أخرى حتى نهاية التجربة.

4. إنشاء نخر العظم الناجم عن الستيرويد لنموذج رأس الفخذ

1. استخدم طريقة ميثيل بريدنيزولون مع عديد السكاريد الدهني (LPS + MPS) لإنشاء نموذج SONFH^16،17. إجراء الحقن داخل الصفاق من LPS (20 ميكروغرام / كغ) باستخدام إبرة قياسية في خط الوسط من بطن الفئران مرة كل 24 ساعة, ليصبح المجموع حقنتين.
2. بعد آخر حقن LPS ، قم بحقن MPS (40 مجم / كجم) في عضلة الألوية أحادية الجانب بعد 24 ساعة من التغذية المنتظمة واستمر في الحقن كل 24 ساعة ، بالتناوب بين منطقتي الألوية ، ليصبح المجموع ثلاث حقن.

5. تجميد تحمل الوزن الخالي من التوتر باستخدام شريط علاجي مرن وتدريب على جهاز المشي

1. ضع علامة على خط الوسط الخلفي للفأر عند 1-2 سم على كلا الجانبين ؛ هذه هي النقطة المرجعية لحمل الوزن. تأكد من وضع العلامات بشكل مناسب لمنع الجرذ من قلب أو إعاقة الحركة أثناء التدريب على جهاز المشي.
2. مع قيام أحد المحققين بإصلاح الجرذ باستخدام القفازات ، ضع إحدى يديك تحت إبط الفئران لتأمين الطرف الأمامي والفك بينما تقوم اليد الأخرى بتأمين الأطراف الخلفية والذيل. تجنب القوة المفرطة لمنع الإجهاد أو الاختناق (الشكل 1 ب).
3. قم بلصق الشريط العلاجي المرن بأنبوب الاختبار دون الضغط لتأمين الحمل على ظهر الفئران. في عملية اللف ، لا تقم بتمديد الشريط العلاجي المرن لتحقيق تثبيت خال من التوتر.
   ملاحظة: تم تصميم الشريط العلاجي المرن المستخدم في هذا النموذج للتسجيل أثناء الأنشطة البدنية المكثفة ، مما يوفر التصاق ومرونة عالية¹⁸. نظرا لمرونته العالية ، فإنه يقلل بشكل كبير من التأثير على حركة الفئران أثناء الزحف.
4. اطلب من المحقق الثاني تثبيت أنبوب الاختبار على ظهر الجرذ بالتوازي مع العمود الفقري للفأر ، مع وضع التثبيت بناء على العلامات التي تم إجراؤها ، أي على بعد 1-2 سم من خط الوسط على جانبي ظهر الفئران.
5. لتقليل معاناة الفئران ، وتقليل التأثير على حركة الفئران ، وتقليل الوفيات الناجمة عن التثبيت ، قم بإجراء التثبيت دون تطبيق التوتر. قم بلصق أنبوب الاختبار بوزن معدل على الشريط العلاجي المرن ، ثم لف أنبوب الاختبار حول جسم الفئران باستخدام تقنية خالية من التوتر.
6. تأكد من الشلل الخالي من التوتر وحافظ على الطول الأصلي للشريط العلاجي المرن دون التمدد من أجل منع أي آثار ضارة على تنفس الفئران وحركتها (الشكل 1 ج).
7. بعد لف أنبوب الاختبار حول جسم الفئران ، ضع الجرذ في مكان مفتوح أو قفص واحد ، وراقب تنفسه واتجاهه. إذا ظهرت علامات التنفس السريع أو فتح الفم ، فحرر الجرذ على الفور لمنع الاختناق.
   1. يسمح الشلل المثالي للفئران بالتحرك بحرية وأداء أنشطة مثل الشرب ورفع الأطراف الأمامية والتغذية (الشكل 1د). إذا كان الشلل غير مرض ، فحرره مؤقتا وأعد الشلل بعد 20 دقيقة لتقليل الضغط على الفئران بسبب محفزات الشلل المتكررة.
8. قم بتشغيل الطاقة واضبط جهاز المشي على 1 م / دقيقة بميل 0 درجة. وقت التدريب على جهاز المشي 30 دقيقة. انقل الجرذ برفق إلى جهاز المشي وابدأ المؤقت.
9. لا تقدم تحفيزا إضافيا للفئران. إذا لم يتمكن الجرذ من إكمال التدريب لمدة 30 دقيقة ، ضعه في قفص لمدة 10 دقائق من الراحة دون إزالة التثبيت.
   ملاحظة: يتميز الشريط العلاجي المرن المستخدم في هذه الدراسة بقابلية تمدد ولصق ممتازين. عند تأمينها بشكل صحيح دون توتر ، لن يتسبب التثبيت طويل المدى في انفصال أنبوب الاختبار أو يؤدي إلى اختناق الفئران وموتها.
10. بعد التدريب ، نظف البراز والبول الذي تركته الفئران ورش الكحول للتخلص من رائحة الحيوان.
11. تجنب الخطوات المذكورة أعلاه التي تراها الفئران الأخرى وتعامل مع بلطف قدر الإمكان لمنع من النطق ، مما يتسبب في إجهاد مؤلم للفئران الأخرى.
12. حرر الجرذ على الفور من التثبيت بعد الانتهاء من التدريب (الشكل 1E). أثناء الإطلاق ، استخدم الأصابع للضغط على فرو الفئران لحمايته ، مما يقلل من فقدان الفراء أثناء الإطلاق (الشكل 1F).

6. تجميع

1. لدراسة تأثير التدريب على حمل الأثقال على SONFH ، قسم 60 فأرا عشوائيا إلى أربع مجموعات.
2. في المجموعة الضابطة ، لا تقم بإنشاء نخر العظم الناجم عن الستيرويد الشائع لرأس الفخذ (SONFH) أو إجراء تدريب على حمل الأثقال. في مجموعة التحكم + الحمل ، قم بإجراء تدريب على تحمل الوزن فقط ، دون إنشاء نخر العظم الناجم عن الستيرويد لنموذج رأس الفخذ. في المجموعة النموذجية ، قم بإنشاء نخر العظم الناجم عن الستيرويد لنموذج رأس الفخذ فقط. في مجموعة النموذج + الحمل ، قم بإجراء تدريب على تحمل الأثقال بعد إنشاء نخر العظم الناجم عن الستيرويد لنموذج رأس الفخذ.

7. القتل الرحيم وجمع العينات

1. ضع الفئران في غرفة القتل الرحيم للحيوانات الصغيرة وحقن ما يكفي من ثاني أكسيد الكربون لتحقيق تركيز أعلى من 5٪. بمجرد أن تفقد الفئران وعيها ، قم بإعطاء جرعة 0.3 مل / كجم من وزن الجسم من محلول كلوريد البوتاسيوم 20٪ ، بإجمالي 20 مل ، عن طريق الحقن داخل القلب.
2. راقب تنفس الفئران ونبضات قلبها للتأكد من عدم شعورها بأي ألم أو إزعاج أثناء القتل الرحيم. تأكد من الوفاة عن طريق التحقق من عدم وجود التنفس وضربات القلب. رش الكحول لتنظيف أي رائحة.
3. بعد القتل الرحيم ، قم بتشريح منطقة ورك الفئران واستخرج رأس الفخذ مع الحفاظ على عظم الفخذ سليما. قم بإجراء فحص التصوير المقطعي المحوسب بعد المعالجة المسبقة ، متبوعا بتلوين الهيماتوكسيلين إيوزين (HE).

8. تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوسين

1. بعد اكتمال النمذجة ، قتل الفئران. قم بإزالة عظم الفخذ من أجل تلطيخ HE.
2. انقع عظم الفخذ في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة للحفاظ على الأنسجة البيولوجية كعينات. انقع عينات عظم الفخذ في حمض الفورميك بنسبة 5٪ لإزالة الكلس لمدة 5 أيام.
3. قسم العينات إلى شرائح 5 ميكرومتر لتلوين HE.
   ملاحظة: تشير الثغرات الفارغة إلى الوضع في أنسجة العظام¹⁹ حيث تكون الثغرات ، التي يجب أن تحتوي عادة على خلايا عظمية ، خالية من هذه الخلايا. إنه مؤشر مهم لتقييم صحة أنسجة العظام. في العملية المرضية لنخر العظام ، قد يتسبب عدم كفاية إمدادات الدم في موت الخلايا العظمية ، مما يؤدي إلى ثغرات فارغة. في تشخيص وتقييم نخر العظام ، يعد عدد وتوزيع الثغرات الفارغة من المعلمات المهمة لقياس شدة المرض^20،21.
   1. ضع عينات الفخذ الفئران في البارافين المذاب (56-60 درجة مئوية) ، ونقعها أولا في البارافين منخفض نقطة الانصهار ، إذا لزم الأمر ، ثم انقلها تدريجيا إلى البارافين ذات نقطة الانصهار الأعلى ، في كل مرة لمدة 1 ساعة تقريبا ، لضمان التسلل الشامل للأنسجة بالبارافين.
   2. قم بإعداد قوالب التضمين وصب البارافين المذاب في القوالب إلى العمق المناسب. استرجع عينات الأنسجة من البارافين باستخدام الملقط بعد النقع ، وقم بإزالة البارافين الزائد ، ووضعها في قوالب. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتصلب البارافين ، وتشكيل كتل البارافين.
   3. باستخدام ميكروتوم البارافين ، قم بتقطيع كتل البارافين المدمجة إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر.
4. اخبز عينات الفئران الفخذية مع الشرائح المرفقة في جهاز تسخين الشرائح لمدة 1 ساعة لتعزيز الالتصاق بين الشرائح والغطاء وتقليل الطفو أثناء عمليات التلوين اللاحقة.
5. اغمر الشرائح المخبوزة بالتتابع في الزيلين النقي لإزالة البارافين ، متبوعا بسلسلة من الجفاف من خلال الإيثانول المطلق ، والإيثانول المتدرج (100٪ ، 95٪ ، 80٪ ، 70٪) ، والماء ، لمدة دقيقتين لكل منهما ، لإكمال عملية إزالة التفارافين وإعادة الجفاف.
6. اغمر الشرائح منزوعة البارافين في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين وصمة لمدة 10 دقائق. اشطفه بالماء الجاري لإزالة الهيماتوكسيلين غير المرتبط.
7. اغمر الأقسام الملطخة بالهيماتوكسيلين في محلول تلطيخ اليوزين وصمة عار لمدة دقيقتين لتلوين السيتوبلازم والنسيج الضام. يشطف بمحلول حمض الأسيتيك 1٪ لإصلاح تأثير التلوين.
8. اغمر شرائح عينة عظم الفخذ الفئران بالتتابع في 70٪ و 80٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪ من الإيثانول ، مع كل تدرج لمدة دقيقتين ، مع إزالة الرطوبة تدريجيا.
9. اغمر شرائح عينة عظم الفخذ في الزيلين النقي للشفافية ، متبوعا بالشطف بالماء الجاري لإزالة الزيلين. ضع راتينج التثبيت المحايد ، وقم بتغطية الشرائح ، واضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء ، والسماح لوسيط التثبيت بالتصلب لإكمال عملية التركيب.
10. باستخدام حزمة randomizr في R ، حدد 30 شريحة HE-stainedslide لكل مجموعة وخصص 15 شريحة لكل من الباحثين. دون إبلاغهم بالتجمعات ، اطلب من الباحثين حساب معدل الثغرات الفارغة للشرائح وجمع النتائج للتحليل الإحصائي.

9. تحليل MicroCT

1. بعد اكتمال النمذجة ، قتل الفئران. قم بإزالة عظم الفخذ من أجل تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوسين.
2. انقع عظم الفخذ في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة للحفاظ على الأنسجة البيولوجية كعينات. ضع عظم الفخذ في جهاز التصوير المقطعي المحوسب الصغير الخاص بالحيوانات الصغيرة.
3. اضبط شروط المسح الضوئي بالأشعة المقطعية الدقيقة على النحو التالي: جهد الأشعة السينية: 80 كيلو فولت ، التيار: 100 ميكرو أمبير ، وقت التعرض الفردي: 50 مللي ثانية ، دقة المسح: 25 ميكرومتر. إجراء عمليات المسح على فترات 0.5 درجة ، مع التركيز على العظم التربقي من أسفل الغضروف إلى الجزء العلوي من المشاشية كمنطقة الاهتمام.
4. حدد المنطقة فوق عنق الفخذ الفئران على أنها منطقة الاهتمام.
5. إجراء إعادة بناء المستوى التاجي لنتائج المسح باستخدام جهاز التصوير المقطعي المحوسب وجمع القياسات مورفومترية للعظام التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج المدمج لجهاز التصوير المقطعي المحوسب. سجل المؤشرات المرصودة التالية: الحجم الكلي (TV) ، النسبة المئوية لحجم العظام (BV / TV) ، نسبة سطح العظام / الحجم (BS / BV) ، سمك الهيكل (Tb.Th) ، فصل الهيكل (tb.sp) ، عدد العظام (tb.N) ، كثافة العظام (BD).

10. التحليل الإحصائي

1. اعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). إجراء التحليلات الإحصائية للتصوير المقطعي المحوسب الجزئي والتقييمات النسيجية الكمية باستخدام اختبار t العينة المستقلة. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تحليل علم الأنسجة المرضية
كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين أنه في المجموعة الضابطة ومجموعة التحكم + الحمل ، كانت تربيق العظام سليمة ومرتبة بانتظام. كانت الخلايا البطانية للأوعية الدموية موجودة في غمازات العظام ، وبدا مورفولوجيا الخلية ممتلئة الجسم. في الم...

Discussion

حاليا ، يمكن استخدام مختلفة ، مثل الأرانب²⁵ ، والجرذان²⁶ ، والفئران²⁷ ، والخنازير²⁸ ، والفروج²⁹ ، والنعام⁸ ، والإيمو³⁰ لإنشاء نماذج لنخر رأس الفخذ. من بينها ، الجرذان والفئران والأرانب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7