تحديد مستوى 8-oxo-dG باستخدام مقايسة ELISA لتقييم تلف الحمض النووي التأكسدي في خلايا MCF-7

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للكشف الكمي عن الضرر التأكسدي للحمض النووي في خلايا MCF-7 بواسطة تقنية ELISA.

Abstract

قاعدة 8-Oxo-7،8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) هي الشكل السائد للضرر التأكسدي للحمض النووي الذي يتم ملاحظته بشكل شائع. يؤثر ضعف الحمض النووي بشكل عميق على التعبير الجيني ويعمل كعامل محوري في تحفيز الاضطرابات التنكسية العصبية والسرطان والشيخوخة. لذلك ، فإن القياس الكمي الدقيق ل 8-oxoG له أهمية سريرية في التحقيق في منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، تشكل الأساليب الحالية للكشف عن 8-oxoG تحديات من حيث الراحة والنفعية والقدرة على تحمل التكاليف والحساسية المتزايدة. استخدمنا تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وهي طريقة قياس لوني عالية الكفاءة وسريعة ، للكشف عن الاختلافات في محتوى 8-oxo-dG في عينات خلايا MCF-7 المحفزة بتركيزات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂). حددنا تركيز H₂O₂ الذي تسبب في الضرر التأكسدي في خلايا MCF-7 عن طريق الكشف عن قيمة IC₅₀ في خلايا MCF-7. بعد ذلك ، عالجنا خلايا MCF-7 ب 0 و 0.25 و 0.75 mM_{H 2}O₂ لمدة 12 ساعة واستخلصنا 8-oxo-dG من الخلايا. أخيرا ، خضعت العينات ل ELISA. باتباع سلسلة من الخطوات ، بما في ذلك نشر اللوحة ، والغسيل ، والحضانة ، وتطوير اللون ، وإنهاء التفاعل ، وجمع البيانات ، اكتشفنا بنجاح التغييرات في محتوى 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 التي يسببها H₂O₂. من خلال هذه المساعي ، نهدف إلى إنشاء طريقة لتقييم درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي داخل عينات الخلايا ، وبذلك ، ندفع قدما في تطوير مناهج أكثر ملاءمة وملاءمة للكشف عن تلف الحمض النووي. يستعد هذا المسعى لتقديم مساهمة ذات مغزى في استكشاف التحليلات الترابطية بين الضرر التأكسدي للحمض النووي ومختلف المجالات ، بما في ذلك البحوث السريرية حول الأمراض والكشف عن المواد السامة.

Introduction

الضرر التأكسدي للحمض النووي هو نتيجة لعدم التوازن بين توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ونظام الدفاع الخلوي المضاد للأكسدة¹. وهو ينطوي في المقام الأول على أكسدة الحمض النووي البيورين وقواعد^{البيريميدين 2,3}. هذا التعديل التأكسدي لقواعد الحمض النووي لا يضر بسلامة الجينوم فحسب ، بل يشمل أيضا مجموعة واسعة من المشكلات المرضية ، بما في ذلك السرطان والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية ^4,5. قاعدة الجوانين في الحمض النووي لديها أقل إمكانية اختزال وهي الأكثر عرضة للأكسدة⁶. لذلك ، يعمل 8-oxo-7،8....

Protocol

1. بناءنموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي الناجم عن H₂O₂ في خلايا MCF-7

1. استعادة الخلايا MCF-7
   1. انقل الأنبوب المبرد لزراعة الخلايا ، والذي يحتوي على 3.5 × 10⁶ خلايا MCF-7 ويتم تخزينه في ثلاجة -80 درجة مئوية ، بسرعة إلى صندوق رغوة يحتوي على النيتروجين السائل. استرجع الأنبوب بالملقط وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تقريبا لإذابة الخلايا المحفوظة.
      ملاحظة: أثناء عملية الذوبان في حمام مائي ، هز الخلايا بشكل متقطع لضمان تسخين موحد للكريوفيال.
   2. ضع المبرد في جهاز طرد مركزي وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 3 ، يشير المحور X إلى تركيز H₂O₂ المطبق على خلايا MCF-7 ، بينما يشير المحور Y إلى صلاحية الخلية. العلاج ب 0.75 mM لمدة 12 ساعة قلل من صلاحية خلايا MCF-7 إلى 67٪. وبالتزامن مع الزيادة في التركيز، كان هناك انخفاض كبير في صلاحية خلايا MCF-7، وخاصة عند تركيز 1.5 ملي?.......

Discussion

يحمل تطوير طرق ELISA أهمية كبيرة لكل من منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي الحالية والجديدة. بالمقارنة مع تقنيات HPLC التقليدية وقياس الطيف الكتلي ، فإن هذا النهج ليس سهل الاستخدام فحسب ، بل يظهر أيضا حساسية عالية ويلبي متطلبات الفحص عالي الإنتاجية³⁰. يتيح ذلك مراقبة 8-oxo-dG في دراسات .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
H2O2(3%)	Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.	1028348
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574