JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للكشف الكمي عن الضرر التأكسدي للحمض النووي في خلايا MCF-7 بواسطة تقنية ELISA.

Abstract

قاعدة 8-Oxo-7،8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) هي الشكل السائد للضرر التأكسدي للحمض النووي الذي يتم ملاحظته بشكل شائع. يؤثر ضعف الحمض النووي بشكل عميق على التعبير الجيني ويعمل كعامل محوري في تحفيز الاضطرابات التنكسية العصبية والسرطان والشيخوخة. لذلك ، فإن القياس الكمي الدقيق ل 8-oxoG له أهمية سريرية في التحقيق في منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، تشكل الأساليب الحالية للكشف عن 8-oxoG تحديات من حيث الراحة والنفعية والقدرة على تحمل التكاليف والحساسية المتزايدة. استخدمنا تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وهي طريقة قياس لوني عالية الكفاءة وسريعة ، للكشف عن الاختلافات في محتوى 8-oxo-dG في عينات خلايا MCF-7 المحفزة بتركيزات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين (H2O2). حددنا تركيز H2O2 الذي تسبب في الضرر التأكسدي في خلايا MCF-7 عن طريق الكشف عن قيمة IC50 في خلايا MCF-7. بعد ذلك ، عالجنا خلايا MCF-7 ب 0 و 0.25 و 0.75 mMH 2O2 لمدة 12 ساعة واستخلصنا 8-oxo-dG من الخلايا. أخيرا ، خضعت العينات ل ELISA. باتباع سلسلة من الخطوات ، بما في ذلك نشر اللوحة ، والغسيل ، والحضانة ، وتطوير اللون ، وإنهاء التفاعل ، وجمع البيانات ، اكتشفنا بنجاح التغييرات في محتوى 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 التي يسببها H2O2. من خلال هذه المساعي ، نهدف إلى إنشاء طريقة لتقييم درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي داخل عينات الخلايا ، وبذلك ، ندفع قدما في تطوير مناهج أكثر ملاءمة وملاءمة للكشف عن تلف الحمض النووي. يستعد هذا المسعى لتقديم مساهمة ذات مغزى في استكشاف التحليلات الترابطية بين الضرر التأكسدي للحمض النووي ومختلف المجالات ، بما في ذلك البحوث السريرية حول الأمراض والكشف عن المواد السامة.

Introduction

الضرر التأكسدي للحمض النووي هو نتيجة لعدم التوازن بين توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ونظام الدفاع الخلوي المضاد للأكسدة1. وهو ينطوي في المقام الأول على أكسدة الحمض النووي البيورين وقواعدالبيريميدين 2,3. هذا التعديل التأكسدي لقواعد الحمض النووي لا يضر بسلامة الجينوم فحسب ، بل يشمل أيضا مجموعة واسعة من المشكلات المرضية ، بما في ذلك السرطان والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية 4,5. قاعدة الجوانين في الحمض النووي لديها أقل إمكانية اختزال وهي الأكثر عرضة للأكسدة6. لذلك ، يعمل 8-oxo-7،8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) كعلامة أولية لتقييم مدى الضرر التأكسدي للحمض النووي 7,8. أصبح القياس الكمي الدقيق ل 8-oxo-dG قضية حاسمة في معالجة الجوانب المختلفة لحدوث المرض وتطوره وتقييم عبء الأكسدة متعدد العوامل9.

الطرق التقليدية للكشف عن 8-oxo-dG ، مثل اللوني السائل عالي الأداء مع الكشف الكهروكيميائي (HPLC-ECD) ، وقياس الطيف الكتلي ، والتقنيات الواصلة ذات الصلة ، تظهر حساسية عالية وخصوصية10،11،12. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لهذه التقنيات متطلبات تشغيلية معقدة وتكاليف عالية ، مما يعوق قابليتها للتطبيق على نطاق واسع وعمليتها في تحليل العينات عالي الإنتاجية. مع التقدم المستمر للعلوم والتكنولوجيا ، ظهرت مجموعة متنوعة من الأساليب الجديدة والفعالة والدقيقة. يتيح لنا تطبيق هذه التقنيات الجديدة تحديد مستوى 8-oxo-dG بشكل أكثر دقة ويوفر أدوات أكثر قوة لإجراء دراسة متعمقة للارتباط بين الإجهاد التأكسدي والمرض. على سبيل المثال ، طبق الباحثون تقنية المسام النانوية للكشف الكمي عن الحمض النووي13 وتسلسله ، وتحديد أنواع تلف الحمض النووي باستخدام استراتيجية تسلسل الكود بنقرة واحدة14 ، وتطوير طرق تسلسل عالية الإنتاجية ، وإنشاء مستشعرات حيوية قائمة على 8-oxoG من خلال دمج البيوتين ستربتافيدين مع ELISA15. من بينها ، ELISA ، بمزاياها المعترف بها من حيث الخصوصية والفحص عالي الإنتاجية والتكلفة ، هي واحدة من الحلول المثالية للكشف عن 8-oxo-dG. لذلك ، من الأهمية بمكان تطوير طريقة عالية الإنتاجية وحساسة للغاية ومريحة وسريعة للكشف عن 8-oxo-dG.

تقدمت تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، التي تم تطويرها في 197116 ، بسرعة على مدار ال 50 عاما الماضية وأصبحت الآن واحدة من أكثر طرق الكشف شيوعا في مجالات البيولوجيا والطب17،18،19. تظهر تقنية ELISA حساسية وخصوصية عالية ، وتمتلك وقت رد فعل قصير ، وسهلة الاستخدام ، مما يجعلها خيارا معترفا به على نطاق واسع لاختبار العينات على نطاق واسع وتحليل عالي الإنتاجية20. نتيجة لذلك ، تم استخدام ELISA على نطاق واسع للتحليل الكمي أو شبه الكمي للمركبات أو البروتينات أو الأجسام المضادة أو الجزيئات داخل الخلايا21،22،23. على سبيل المثال ، تم استخدامه في الكشف عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بالأمراض المختلفة وبقايا الأدوية والجزيئات الحيوية24. يمكن تصنيف ELISAs إلى أربعة أنواع رئيسية بناء على التصميم التجريبي والمبادئ25. تشمل هذه الطرق ELISA المباشر ، و ELISA غير المباشر ، و ELISA الساندويتش ، و ELISA26,27 التنافسي. من بين هذه ، شطيرة ELISA ، التي تستخدم اثنين من الأجسام المضادة المحددة ، واحد لالتقاط الجزيء المستهدف والآخر للكشف ، تم اختياره للدراسة في هذه الورقة. المبدأ التجريبي لشطيرة ELISA هو كما يلي: أولا ، يتم تثبيت جسم مضاد معين في آبار الصفيحة الدقيقة لالتقاط المادة المراد تحليلها. بعد إضافة المعيار أو العينة، يرتبط المحلول المراد تحليله بالجسم المضاد المتجمد. بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد مسمى يتعرف على حاشية مختلفة على المستضد ، مكونا بنية شطيرة. بعد إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة ، تتم إضافة الركيزة. تحت التأثير الحفاز للجسم المضاد الثانوي ، يحدث تفاعل اللون ، وترتبط شدة اللون ارتباطا إيجابيا بتركيز المادة المراد تحليلها في العينة. أخيرا ، تم قياس الكثافة الضوئية (OD) لتحديد تركيز العينة. يتميز Sandwich ELISA بمزايا زيادة الحساسية والنوعية للعينات المستهدفة ، مما يجعله مناسبا للكشف عن تركيزات منخفضة من التحليلات المستهدفة والعينات المعقدة28. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس النتائج التي تم الحصول عليها لمزيد من التحليل. هذه العوامل تجعل شطيرة ELISA طريقة كشف شائعة الاستخدام في كل من البحث العلمي والمختبرات السريرية29.

تهدف هذه الدراسة إلى الكشف الكمي عن 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 لتحديد درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي في الخلايا. تتكون هذه الدراسة من جزأين رئيسيين: بناء نموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي لخلية MCF-7 والكشف عن 8-oxo-dG باستخدام ELISA. أولا ، تم استزراع خلايا MCF-7 في المختبر ومعالجتها بتركيزات مختلفة من H2O2 لفترات مختلفة. تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة CCK-8 لتحديد التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) ل H2O2 في خلايا MCF-7. بناء على قيم IC50 ، تم اختياروقت علاج H 2O 2 المناسب وتركيز الحث. لاستخراج عينات من خلايا MCF-7 التي تضررت من الأكسدة ، تم الحصول على عينات الخلايا والمواد الطافية وإضافتها إلى الآبار المرتبطة بالإنزيم المطلية مسبقا بأجسام مضادة 8-oxo-dG. سوف يرتبط 8-oxo-dG الموجود في العينة بالأجسام المضادة المرتبطة بحامل الطور الصلب. بعد ذلك ، تمت إضافة 8-oxo-dG الأجسام المضادة الموسومة ببيروكسيديز الفجل. تم تحضين خليط التفاعل عند درجة حرارة ثابتة لضمان الارتباط الكامل للعينة والجسم المضاد. تمت إزالة الإنزيم غير المنضم عن طريق الغسيل ، ثم تمت إضافة الركيزة اللونية ، والتي أنتجت لونا أزرق. تحت تأثير الحمض ، تحول المحلول إلى اللون الأصفر. أخيرا ، تم قياس قيمة OD لعينات بئر التفاعل عند 450 نانومتر ، وكان تركيز 8-oxo-dG في العينة متناسبا مع قيمة OD. من خلال توليد منحنى قياسي ، يمكن حساب تركيز 8-oxo-dG في العينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. بناءنموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي الناجم عن H2O2 في خلايا MCF-7

  1. استعادة الخلايا MCF-7
    1. انقل الأنبوب المبرد لزراعة الخلايا ، والذي يحتوي على 3.5 × 106 خلايا MCF-7 ويتم تخزينه في ثلاجة -80 درجة مئوية ، بسرعة إلى صندوق رغوة يحتوي على النيتروجين السائل. استرجع الأنبوب بالملقط وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تقريبا لإذابة الخلايا المحفوظة.
      ملاحظة: أثناء عملية الذوبان في حمام مائي ، هز الخلايا بشكل متقطع لضمان تسخين موحد للكريوفيال.
    2. ضع المبرد في جهاز طرد مركزي وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية من أنبوب التخزين المبرد وإضافة 1 مل من وسط الاستزراع الكامل. تخلط جيدا وتنقل إلى طبق استزراع 10 مم ، وتكمل 7 مل إضافية من وسط الاستزراع الكامل.
    4. رج طبق الاستزراع في نمط متقاطع لضمان خلط موحد ، واستزراع في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع الكامل من وسط زراعة DMEM المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين وستربتومايسين.
  2. تقييم صلاحية الخلية
    1. حدد خلايا MCF-7 في مرحلة النمو اللوغاريتمي ذات الحالة الخلوية الجيدة للتجربة. خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي ، تظهر الخلايا عادة دورة انقسام أقصر وتواترا عاليا لانقسام الخلايا.
      1. مراقبة مورفولوجيا ومعدل نمو خلايا MCF باستخدام المجهر الإلكتروني. عندما تقدم الخلايا مورفولوجيا أحادية الطبقة موحدة ومعبأة بكثافة ، ويكون تكاثر الخلايا واضحا ، يمكن تحديد أن الخلايا في الأساس في مرحلة النمو اللوغاريتمي.
    2. غسل الخلايا: استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من طبق الاستزراع ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت PBS لغسل الخلايا ، ثم تخلص من PBS.
    3. انفصال الخلايا: أضف 1 مل من التربسين لغسل الخلايا ، وانتظر لمدة دقيقة تقريبا حتى يفصل التربسين الخلايا تماما عن طبق الاستزراع. اضغط برفق على طبق الثقافة. مراقبة حركة الخلية
      في أوراق يشير إلى انفصال الخلية شامل.
    4. إنهاء انفصال الخلايا وعد الخلايا: أضف 8 مل من وسط الاستزراع الكامل لإنهاء الانفصال ، وخلايا الماصة برفق ، وحدد تركيز تعليق الخلية باستخدام جهاز عد الخلايا.
      ملاحظة: تأكد من أن تعليق الخلية متجانس قبل العد عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل.
    5. بذر الخلايا: اضبط تعليق الخلية المخفف لتحقيق كثافة خلية تبلغ 5000 خلية لكل 100 ميكرولتر. قم بتلقيح معلق الخلية في 21 بئرا من صفيحة 96 بئرا باستخدام مسدس ماصة ، مع توزيع 100 ميكرولتر في كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS إلى الآبار المحيطة بالآبار المزروعة لمنع التبخر المفرط لوسط الاستزراع.
    6. تحضير الوسط المحتوي على H2O2: اختر 9 آبار على لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا وقم بتعيين الملصقات بناء على تدرج تركيزات H2O2 (0 ، 0.25 ، 0.50 ، 0.75 ، 1.0 ، 1.5 ، 2.0 mM). أضف 720 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الآبار المسماة 2.0 mM و 1.5 mM وأضف 360 μL من الوسط الكامل إلى الآبار المتبقية.
      1. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع 1.63 ميكرولتر و 1.22 ميكرولتر من كاشف H2O2 بنسبة 3٪ في الآبار المسمى 2.0 mM و 1.5 mM ، على التوالي. خلط الحل جيدا. باستخدام ماصة ، انقل 360 ميكرولتر من 2.0 mMH 2O2 إلى البئر المسمى 1.0 mM واخلطه ؛ ثم ، قم بنقل 360 ميكرولتر من 1.0 mM H2O2 إلى 0.5 mM المحدد جيدا واخلطه ؛ وأخيرا نقل 360 ميكرولتر من 0.5 mMH 2O2 إلى البئر ملحوظ 0.25 mM. ماصة 360 ميكرولتر من 1.5 mMH 2O2 في البئر المسمى 0.75 mM لتخفيف وتحقيق التركيز المطلوب. (الشكل 1).
        ملاحظة: تأكد من نقل محلول المخزون H2O2 في الماصة بالكامل إلى الآبار لتجنب أي محلول متبقي. تأكد من الخلط الشامل للحلول قبل الشروع في التخفيف.
    7. الحضانة: بعد حوالي 24 ساعة من بذر الخلايا ، استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من الصفيحة المكونة من 96 بئرا بمجرد التصاق الخلايا بالأسطح. وفقا لتدرج التركيز ، أضف الوسط المحتوي على H2O2 المعني إلى كل بئر. أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة.
    8. إضافة كاشف CCK-8: بعد فترة المعالجة المحددة لمدة 12 ساعة ، استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من لوحة 96 بئرا ، وإضافة 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل و 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 إلى كل بئر ، وتشمل ثلاثة آبار تحكم فارغة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: أثناء عملية إضافة العينات ، تجنب تكوين الفقاعات لمنع أي تداخل مع قراءة قيمة OD.
    9. قياس الامتصاص: أخرج لوحة 96 بئرا من الحاضنة ، وقم بقياس الامتصاص بطول موجي يبلغ 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، وسجل النتائج.
    10. وفقا لصيغة حساب IC50 ،
      معدل التثبيط (٪) = (OD للمجموعة التجريبية للدواء - متوسط OD لثقب التحكم في الدواء) / (متوسط OD لثقب التحكم في الخلية - متوسط OD لثقب التحكم في الدواء) × 100٪
      احسب النتائج كنسبة مئوية من الامتصاص في مزارع التحكم.
    11. قم باستيراد البيانات التجريبية المعالجة إلى برنامج تحليل إحصائي ، وحدد نوع التحليل الانحدار غير الخطي ، وقم ببناء النموذج اللوجستي المكون من أربعة معلمات ، وتابع النقر فوق الزر Fit Curve لتركيب المنحنى. بعد عملية التركيب ، سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب قيمة IC50 .
  3. تجربة أكسدة الخلايا MCF-7 المستحثة H2O2
    1. استرجع خلايا MCF-7 في مرحلة النمو اللوغاريتمي مع حالة خلية جيدة للتجريب.
    2. اغسل ، وقم بإجراء انفصال الخلية ، وقم بإنهاء الانفصال ، وعد الخلايا (راجع الخطوة 1.2 للحصول على طرق محددة).
    3. بذر الخلية: اضبط كثافة تعليق الخلية إلى 1 × 106 خلايا لكل طبق ، مع 4 مل من المعلق لكل طبق قطره 6 سم.
    4. قم بتسمية أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 5 مل على أنهما 0.25 مللي متر و 0.75 مللي مول 3٪ H2O2. أضف 4 مل من الوسط الكامل لكل أنبوب ، ثم أضف 1.13 ميكرولتر و 3.40 ميكرولتر من 3٪ H2O2 ، على التوالي. هز الأنابيب برفق لضمان الخلط الشامل. استبدل وسط الاستزراع في الأطباق الثلاثة بوسط كامل يحتوي على تركيزات H2O2 من 0 و 0.25 و 0.75 mM.
    5. احتضان الثقافات: أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة.

2. تحضير العينات الخلوية وإعداد كواشف ELISA

  1. جمع عينات استخراج الخلايا
    1. جمع العينات: تخلص من طاف زراعة الخلايا MCF-7 ، وشطفه ، وقم بإجراء انفصال الخلايا ، وإنهاء الانفصال ، وجمع الخلايا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    2. الطرد المركزي: جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق لجمع حبيبات الخلية. أضف 200 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق كل عينة خلية وتعطيل الخلايا عن طريق دورات التجميد والذوبان المتكررة. أجهزة الطرد المركزي تحلل الخلية عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية لتحليلها.
      ملاحظة: عندما تكون كمية الخلية منخفضة ، قم بتقليل حجم PBS المستخدم للتعليق. يمكن تخزين العينات في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع إذا كان التحليل الفوري غير ممكن. للتخزين طويل الأجل ، قم بتقسيم العينات بناء على الكميات ذات الاستخدام الواحد وتخزينها في -80 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
  2. تحضير كواشف ELISA
    1. إذابة الكواشف: اسمح لكواشف ELISA ، بما في ذلك أغشية الختم ، والألواح المطلية مسبقا ، والمعايير ، ومخفف العينة ، والأجسام المضادة للكشف عن HRP ، وركيزة الكروموجين ، ومحلول التوقف ، ومخزن الغسيل المركز (20x) ، وعينات الاختبار للوصول إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة قبل بدء الفحص. افتح قارئ ELISA مسبقا قبل 15 دقيقة من الاستخدام.
    2. تحضير المخزن المؤقت للغسيل: احسب الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للغسيل المخفف ، ثم قم بتخفيف محلول الغسيل المركز 20x بالماء المقطر أو منزوع الأيونات إلى محلول عمل 1x. أعد أي مخزن مؤقت مركز غير مستخدم إلى الثلاجة على درجة حرارة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للغسيل طازجا قبل الاستخدام. إذا كانت البلورات موجودة في مخزن الغسيل المركز المخزن في الثلاجة ، اتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة ورجه برفق حتى تذوب البلورات تماما قبل الاستخدام.
    3. إعداد المعيار
      1. تحضير حلول العمل للعينات القياسية بتركيزات 1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 نانوغرام / مل على التوالي. لضمان دقة النتائج التجريبية ، امزج العينات القياسية بعناية لأعلى ولأسفل قبل الاستخدام لتجنب تكوين الفقاعات أثناء عملية الذوبان.

3. تجربة إليسا

  1. طلاء اللوحة: صمم العدد الإجمالي للآبار للمعايير والعينات والفراغات / الضوابط مسبقا وأخرج شرائط الألواح المطلوبة. أضف 50 ميكرولتر من محلول العمل القياسي وعينات الكشف بتركيزات مختلفة إلى آبار التفاعل. تنفيذ المعايير في ثلاث نسخ والامتناع عن إضافة أي عينات إلى الآبار الفارغة / التحكم25.
    ملاحظة: تظهر الخطوات التجريبية لمقايسة ELISA بشكل تخطيطي في الشكل 2. إذا تجاوز تركيز العينة نطاق الكشف ، فيجب تخفيف العينة بمخفف العينة قبل أخذ العينات. عند إضافة عينات ، أضفها إلى أسفل اللوحة ، وتجنب لمس جدران البئر ، واهتز برفق للخلط ، وتجنب تكوين الفقاعات. لضمان دقة التجربة ، يجب إكمال كل إضافة عينة في غضون 10 دقائق.
  2. الحضانة: باستثناء الآبار الفارغة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن بيروكسيديز الفجل (HRP) إلى كل بئر تفاعل ، وأغلق الآبار بختم صفيحة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حاضنة درجة حرارة ثابتة.
  3. الغسيل: تخلص من السائل ، وتخلص من السائل في آبار الألواح ، واتركه حتى يجف على ورق ماص ، وأضف 350 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى كل بئر تفاعل ، واتركه لمدة 1-2 دقيقة ، ثم تخلص من المخزن المؤقت للغسيل. كرر عملية الغسيل 5x.
    ملاحظة: الغسيل الشامل أمر بالغ الأهمية لأنه يؤثر بشكل مباشر على دقة النتائج التجريبية. تأكد من التخلص من المخزن المؤقت للغسيل تماما بعد كل غسلة. امسح بعناية أي بقايا في الجزء السفلي من اللوحة بعد الغسيل لتجنب التأثير على قياس الامتصاص.
  4. تفاعل اللون: أضف 50 ميكرولتر من الركيزة A و 50 ميكرولتر من الركيزة B إلى كل بئر تفاعل ، وأغلق اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: بعد إضافة كاشف اللون ، لاحظ تغير اللون في آبار التفاعل على الفور. إذا كان اللون داكنا جدا ، أضف محلول التوقف لإنهاء التفاعل مسبقا.
  5. قم بإنهاء التفاعل وقياس الامتصاص: أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر تفاعل ، وقم على الفور بقياس قيمة OD عند الطول الموجي 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA (في غضون 15 دقيقة).
  6. تحليل البيانات: استيراد البيانات التجريبية المعالجة إلى برنامج التحليل الإحصائي ، حدد نوع التحليل الانحدار الخطي. قم ببناء منحنى معايرة عن طريق رسم تركيز المعايير على المحور X مقابل قيم الكثافة الضوئية (OD) على المحور Y. استخدم منحنى المعايرة المحدد للتأكد من تركيز 8-oxo-dG الموجود في العينات. قم ببناء نموذج رياضي لوجستي وتابع النقر فوق الزر Fit Curve لتركيب المنحنى. بعد عملية التركيب ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب المنحنى القياسي وقيمة P.
    ملاحظة: لا يمكن إعادة استخدام المنحنى القياسي ويجب تحديده من جديد لكل تجربة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 3 ، يشير المحور X إلى تركيز H2O2 المطبق على خلايا MCF-7 ، بينما يشير المحور Y إلى صلاحية الخلية. العلاج ب 0.75 mM لمدة 12 ساعة قلل من صلاحية خلايا MCF-7 إلى 67٪. وبالتزامن مع الزيادة في التركيز، كان هناك انخفاض كبير في صلاحية خلايا MCF-7، وخاصة عند تركيز 1.5 ملي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يحمل تطوير طرق ELISA أهمية كبيرة لكل من منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي الحالية والجديدة. بالمقارنة مع تقنيات HPLC التقليدية وقياس الطيف الكتلي ، فإن هذا النهج ليس سهل الاستخدام فحسب ، بل يظهر أيضا حساسية عالية ويلبي متطلبات الفحص عالي الإنتاجية30. يتيح ذلك مراقبة 8-oxo-dG في دراسات ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل فريق البحث المبتكر لمؤسسة جيانغسو للتعليم العالي للعلوم والتكنولوجيا (2021) ، وبرنامج مركز أبحاث تكنولوجيا الهندسة بكلية جيانغسو المهنية (2023) ، وبرنامج التكنولوجيا الرئيسية لمشاريع تكنولوجيا معيشة شعب سوتشو (SKY2021029) ، والمشروع المفتوح لبنك جيانغسو الحيوي للموارد السريرية (TC2021B009) ، ومشروع مختبر الدولة الرئيسي للطب الإشعاعي والحماية ، جامعة سوشو (GZK12023013) ، وبرامج كلية سوتشو للصحة المهنية (SZWZYTD202201) ، ومشروع تشينغ لان بمقاطعة جيانغسو في الصين (2021 ، 2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)Gibco25200-072
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Cell Counting PlateQiuJingXB-K-25
CO2 incubatorThermo51032872
DMEM basic(1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad Softwarestatistical analysis software
high-speed centrifugeThermo 9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA KitZcibioZC-55410
L-1000XLS+ PipettesRainin17014382
L-20XLS+ PipettesRainin17014392
liquid nitrogen tankMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 CELLBNCCBNCC100137
Multiskan FC microplate photometerThermo1410101
PBSSolarbioP1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XBeyotimeC0222
Trinocular live cell microscopeMotic1.1001E+12
Ultra-low temperature freezerHaireV118574

References

  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
  4. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  5. Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
  6. Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
  7. Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
  8. Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401(2022).
  9. Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
  10. He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
  11. Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
  12. Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
  13. An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
  14. Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
  15. Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
  16. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  17. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  18. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).
  19. Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
  20. Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).
  21. Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
  22. Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
  23. Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
  24. Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
  26. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  27. Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
  28. Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
  29. Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).
  30. Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
  31. Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
  32. Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
  33. Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312(2023).
  34. Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

8 oxo dG ELISA MCF 7

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved