JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي استخدام تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي لمصادقة المواد الطبية النباتية ، والنبات الطبي Angelica sinensis (Oliv.) تم تحديد Diels كمثال.

Abstract

تعتبر النباتات الطبية موارد قيمة على مستوى العالم وتستخدم في جميع أنحاء العالم للحفاظ على الصحة وعلاج الأمراض. ومع ذلك ، فإن وجود الغش يعيق تطورها. يسهل الترميز الشريطي للحمض النووي ، وهو تقنية لتحديد الأنواع من خلال مناطق الحمض النووي القياسية ، التعرف الفوري والدقيق على النباتات الطبية التقليدية. تستلزم عملية الترميز الشريطي للحمض النووي ست خطوات أساسية: 1) معالجة النباتات الطبية ، 2) استخراج الحمض النووي الكلي عالي الجودة من النباتات الطبية باستخدام طريقة عمود الطرد المركزي ، 3) تضخيم فاصل الحمض النووي الداخلي المنسوخ لمنطقة الحمض النووي المستهدفة 2 (ITS2) باستخدام بادئات عالمية للنباتات وإجراء تسلسل سانجر ، 4) الربط والمحاذاة للحصول على التسلسل المستهدف ، 5) مطابقة تسلسل الباركود مع مكتبة الباركود لتحديد الهوية ، 6) محاذاة التسلسل ، ومقارنة التباين غير المحدد وبين الأنواع ، وبناء شجرة الانضمام إلى الجيران النشوء والتطور. كما هو موضح في النتائج ، يمكن للبرايمر العالمي تضخيم المنطقة المستهدفة. توضح أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) أن النسبة المئوية المحددة كانت 100٪، وتوضح الشجرة المنضمة إلى الجار أن تسلسلات الربط تم تجميعها مع A. sinensis OR879715.1 clade، وقيمة دعم الكليد هي 100. يوفر هذا البروتوكول مرجعا لتطبيق تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي كطريقة فعالة لتحديد النباتات الطبية والمواد المغلفة.

Introduction

للنباتات الطبية مجموعة واسعة من التأثيرات الدوائية وهي مواد مهمة لعلاج الأمراض والوقاية منها. طلب السوق على النباتات الطبية في الأدوية العشبية والمنتجات الصيدلانية ضخم ولا يزال في ازدياد. مع تزايد سوق النباتات الطبية ، أعاقت مشكلة الغش نمو النباتات الطبية. حاليا ، يعاني غش النباتات الطبية من هذه الأسباب: 1) التشكل المماثل للنباتات الطبية يجعل من الصعب التعرف عليها واستخدامها بشكل صحيح1،2،3،4،5 ، 2) أدى الطلب المتزايد على النباتات الطبية إلى عدم كفاية العرض في السوق6،7، 3) النباتات الطبية باهظة الثمن ولها أسعار متقلبة ، وقد أدى استخدام الأعشاب الرخيصة بدلا من المواد ذات القيمة الاقتصادية إلى الغش والتربح من السوق8،9. لحل مشاكل التحديد الصحيح للنباتات الطبية واستخدامها ، هناك حاجة إلى تقنية تسمح لغير المتخصصين بتحديد المصدر10.

هناك قيود على تحديد النباتات الطبية واستخدامها بشكل صحيح من خلال المظهر والرائحة وحدهما11. لتحديد أكثر دقة ومراقبة الجودة ، يتم استخدام الطرق الفيزيائية والكيميائية12. كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) ، على سبيل المثال ، هي طريقة سريعة لتحديد الأعشاب الطبية وهي مدرجة في دستور الأدوية الصيني. ومع ذلك ، فإنه يتطلب معايير مرجعية لتحديد النباتات13. يمكن للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إجراء اختبارات نوعية وكمية ، مما يجعلها مناسبة لاختبار جودة الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذه الأداة باهظة الثمن وتتطلب معرفة متخصصةلتشغيلها 14،15. تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي هي تقنية سريعة ودقيقة لتحديد الأنواع تحدد الأنواع باستخدام تسلسل الحمض النووي المستقر للتمييز بين النباتات ذات التشكل المماثل. اقترح Hebert et al. تقنية الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد الأنواع ، والتي تستخدم تسلسل DNA معترف به وقصير نسبيا داخل الجينوم16 ، اقترح Chen et al. ITS2 كتسلسل عالمي للتحديد الجزيئي للنباتات الطبية وحدد أكثر من 6600 نبات ووجد قدرة عالية على تحديدالهوية 17. أظهرت دراسة النباتات الطبية القائمة على شظايا جين ITS2 والبلاستيدات الخضراء القدرة على تمييز الأنواع على مستوى الأنواع ، مع تطبيقات في مجالات حماية الموارد وتنظيم السوق والتجارة الدولية17 ، 18 ، 19. يمكن أن يتغلب تطبيق الترميز الشريطي للحمض النووي على قيود طرق تحديد الهوية التقليدية ، وهو أمر مفيد في ضمان جودة وسلامة النباتات الطبية ، ومنع إساءة استخدام الموارد والارتباك20. لقد أثبت أنه مفيد لدراسة النباتات الطبية ، ودعم نمو صناعة الأعشاب بطريقة مستدامة ، وتوفير ضمان أن المستهلك يستخدم الدواء الصحيح21،22،23،24.

تحدد الورقة بروتوكولات لكيفية تطبيق الترميز الشريطي للحمض النووي لتحديد النباتات الطبية باستخدام A. sinensis كمثال. يستخدم الترميز الشريطي للحمض النووي واحدا أو أكثر من العلامات الجينية القصيرة الموحدة في الحمض النووي للكائن الحي للتعرف عليه على أنه ينتمي إلى نوع معين. الطرق الحالية لتحديد النباتات الطبية لها قيود معينة. يعتمد التحديد المورفولوجي التقليدي بشكل كبير على خبرة الخبراء الواسعة ، والتي يمكن أن تتأثر بالعوامل البشرية ، في حين أن التحديد الكيميائي عرضة لقضايا مثل غش المركبات الرئيسية. في المقابل ، يوفر الترميز الشريطي للحمض النووي وسيلة أكثر دقة لتحديد الأنواع ، مما يوفر مزايا مثل السرعة وقابلية التكاثر العالية والاستقرار. علاوة على ذلك ، تتيح هذه التكنولوجيا الإدارة المركزية ومشاركة بيانات تسلسل الأنواع الحالية من خلال الإنترنت ومنصات المعلومات ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة وموثوقية تحديد الأنواع11،12. نظرا لتشابهها في مورفولوجيتها وأجزائها الطبية ، غالبا ما يتم الخلط بين A. sinensis والأنواع الأخرى وكثيرا ما يساء استخدامها أو يتم استبدالها عمدا في السوق25. حدد يانغ وآخرون A. الشذوذ باستخدام الترميز الشريطي للحمض النووي لتمييزه عن الأدوية الكاذبة26. يوان وآخرون جمع 23 نوعا من حشيشة الملاك واستخدموا الترميز الشريطي للحمض النووي للتمييز بين الأنواع المختلفة27. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، سيتمكن المستخدمون من مصادقة المواد الطبية النباتية من المعالجة المسبقة إلى مطابقة تسلسل الترميز الشريطي في النهاية مع قاعدة بيانات الباركود (الشكل 1).

Protocol

1. تحضير العينة

  1. استخدمت الدراسة الحالية A . sinensis البالغ من العمر عامين مع درجة حرارة منخفضة وأشعة الشمس الطويلة على ارتفاع 2800 متر من مقاطعة مين بمقاطعة قانسو كمواد تجريبية. تم اختيار ثلاثة نباتات تم اختيار أكثر من ثلاثة جذور منها للتجريب. اشطف الجذور أولا بالماء المعقم ثم نظفها باستخدام بخاخ الكحول أو مسحات الكحول لمنع التلوث الذي قد يؤثر على دقة النتائج التجريبية. قطع الجذور إلى قطع أصغر من 5 مم باستخدام مشرط معقم وتخلط لمزيد من التحليل. (الشكل 2).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، ضع الجذور في النيتروجين السائل حتى تنضج ، مما يسهل كسرها اعتمادا على شكل النباتات الطبية وصلابتها وخصائصها الأخرى ، استخدم الأدوات للتعامل معها.
  2. إعداد ثلاثة أنابيب من العينات التجريبية للتجارب المتوازية. قم بتسمية كل عينة على أنها AS-1 و AS-2 و AS-3. خذ حوالي 100 مجم من المناديل الطازجة أو 20 ملغ من الوزن الجاف (المجففة بالهواء) وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
  3. ضع حبتين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 5 مم في أنابيب الطرد المركزي سعة 2 مل. انقل الأنابيب إلى مطحنة مناديل عالية الإنتاجية تعمل بسرعة 60 هرتز لمدة 60 ثانية.

2 استخراج الحمض النووي من العينة

ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني النباتي ، والتي تعتمد على طريقة CTAB. يتم إجراء استخراج الحمض النووي باتباع دليل التعليمات مع بعض التعديلات ، بما في ذلك إضافة عازل عزل نووي فريد (NIB). يعمل البروتوكول على تحسين نقاء الحمض النووي عن طريق فصل الملوثات أولا عن الأنسجة ثم إضافة خطوة عزل النوىالأولية 28،29،30.

  1. أضف 800 ميكرولتر من NIB المبرد مسبقا وضع العينة على خلاط دوامة ، واهتز لمدة 5 دقائق.
  2. ضعها في جهاز طرد مركزي وقم بمعالجتها على حرارة 13,780 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية.
  3. كرر الخطوات 2.1-2.2 لمدة 3 جولات إضافية.
    ملاحظة: يستخرج NIB الحمض النووي عالي الجودة ، ويحتوي تحضيره على بعض المواد الكيميائية الخطرة التي يجب التعامل معها في غطاء الدخان ، مما يجعل من الصعب على المبتدئين التعامل معها. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة ليست إلزامية. يمكن للمستخدمين اختيار اتباع هذه التوصية أو تخطي هذه الخطوات. صياغته التفصيلية في الجدول 1.
  4. أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 و 5 ميكرولتر من RNase A (10 مجم / مل). ضع العينة على خلاط دوامة ودوامة للخلط. احتضان العينات في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة ، مع قلب الأنابيب 2x-3x أثناء الحضانة.
  5. أضف 200 ميكرولتر من Buffer P2 ، واخلطها جيدا ، وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 10 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية بعناية على عمود مرشح AF ، وجهاز طرد مركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين ، وانقل المرشح السفلي الذي تم جمعه في أنبوب التجميع إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  7. احسب حجم الترشيح ، وأضف 1.5 ضعف حجم P3 ، ورجها على الفور للحصول على محلول مختلط.
  8. يضاف 650 ميكرولتر من الخليط المحضر إلى عمود امتصاص عمود ماص (AC) ويحتضنه لمدة 5 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 30-60 ثانية.
  9. أضف المرشح الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.8 إلى التيار المتردد مرة أخرى ، وجهاز الطرد المركزي ، وتخلص من سائل النفايات. كرر الإجراء مع المحلول المختلط المتبقي من الخطوة 2.7.
  10. أضف 600 ميكرولتر من محلول الشطف WB ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من محلول النفايات ، وكرر الإجراء 1x.
  11. ضع عمود التيار المتردد مرة أخرى في أنبوب التجميع الفارغ ، وجهاز الطرد المركزي عند 13،780 × جم لمدة دقيقتين ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لإزالة الإيثانول المتبقي.
  12. خذ التيار المتردد للعمود الممتز وضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل. أضف 45 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات المعقم (ddH2O) إلى منتصف الغشاء الممتز ، الذي تم تسخينه إلى 65 درجة مئوية. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين.
  13. أضف المحلول الناتج مرة أخرى إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 13,780 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  14. اجمع المحلول الذي تمت تصفيته. استخدام مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الحمض النووي. يمثل OD260 امتصاص الأحماض النووية. استخدم المعايير التالية لمعيار تحديد جودة الحمض النووي: OD260 / OD280 = 1.80-2.00 ، المعدل الطبيعي ؛ OD260/OD280>2.00; هناك كمية كبيرة من تلوث الحمض النووي الريبي ؛ OD260 / OD280<1.80 ، هناك بروتينات وفينولات وملوثات أخرى.

3 تضخيم الجزء المستهدف واكتشافه

ملاحظة: حدد بادئات التضخيم المناسبة بناء على مناطق الترميز الشريطي للحمض النووي المقترحة للنبات ؛ يتم عرض ظروف التفاعل في الجدول 2.

  1. قم بإعداد ظروف التفاعل المقابلة لتضخيم التمهيدي. استخدم أنابيب الطرد المركزي سعة 0.2 مل مملوءة ب 9.5 ميكرولتر من ddH2O ، و 12.5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 1 ميكرولتر لكل من التمهيدي الأمامي ، والتمهيدي العكسي ، وقالب الحمض النووي لحجم إجمالي يبلغ 25 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي ، واستبدل القالب بالماء.
  2. أضف 20 مل من 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) و 0.2 جم من الاغاروز للتسخين وتحضير هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، ثم أضف 2 ميكرولتر من صبغة هلام الحمض النووي (10،000x) واخلطها جيدا. يسكب المزيج في صينية صب الجل ويترك ليتصلب للحصول على جل الاغاروز. أضف 3 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل و 2 ميكرولتر من علامة الحمض النووي 5000 نقطة أساس إلى الجل.
  3. اضبط الجهد على 120 فولت ، والتيار عند 400 مللي أمبير ، والرحلان الكهربائي لمدة 40 دقيقة. استخدم نظام تحليل صور هلامي متعدد الاستخدامات لعرض المواد الهلامية والتحقق من النتائج.

4. جمع البيانات وتحليلها

ملاحظة: هناك مجموعة واسعة من برامج تجميع وتحليل التسلسل. نستخدم كود Codon Aligner V11.0.1 و MEGA11 كأمثلة للتوضيح.

  1. استخدم التقويم لفتح ملف التسلسل لمراقبة خريطة الذروة ولصق ملفات خريطة ذروة التسلسل ثنائي الاتجاه.
    1. حدد إنشاء مشروع جديد وانقر فوق موافق للانتقال إلى الصفحة الرئيسية للبرنامج. حدد إضافة عينات ضمن القائمة ملف، وحدد الملف المراد معالجته كتنسيق تتبع تسلسل، واستيراده مباشرة إلى البرنامج كملف مستورد في عينات غير مجمعة.
    2. اختر Contig، ثم في القسم، اختر تجميع متقدم، ثم اختر تجميع في مجموعات. سيرى المستخدمون لأول مرة، بعد تحديد التجميع في المجموعات، مربع الحوار هذا: اختر تحديد الأسماء. قم بتعديل أجزاء اسم العينة وفقا لاسم الملف وانقر فوق تجميع. سيتم عرض التسلسل المحاذاة.
    3. استرجع تسلسلات ITS2 الكاملة وفقا لتحليل النموذج المستند إلى نموذج ماركوف المخفي (HMM). استخدم تسلسلات 5.8 ثانية (CGAGGGCACCCTGCCTGGGCGTCA) و 28 ثانية (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 للبحث في التسلسل المحاذاة من البداية لإزالة مناطق 5.8 ثانية و 28 ثانية.
    4. حدد Go ، ثم ، في القسم ، حدد Search Sequence وانقر فوق OK للحصول على التسلسل المطابق. اختر Contig ، واختر حذف في القسم لإزالة مناطق 5.8 ثانية و 28 ثانية والتسلسلات منخفضة الجودة ، ثم سيقوم البرنامج بإخراج تسلسلات الربط للمطابقة.
  2. استخدم تسلسلات التضفير التي تم الحصول عليها من الخطوات التجريبية الثلاث المتوازية لتحديد الهوية ، وحدد بحث BLAST باستخدام قاعدة بيانات النيوكليوتيدات في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) ، وحدد أداة تحديد الأنواع والتمهيدي المحدد ITS2 المقابلة في قاعدة بيانات جينوم دستور الأدوية العالمية (GPGD).
    ملاحظة: يتضمن NCBI32 و GPGD33 تسلسل النيوكليوتيدات للنباتات الطبية ويتم التعرف عليهما كقواعد بيانات موثوقة. طرقهم الرئيسية لتحديد الهوية هي الطرق القائمة على مقارنة التسلسل34 (BLAST). يتم استخدام الهوية المئوية من نتائج الهوية لتحديد ما إذا كانت الأنواع ذات التشابه الأكبر هي الجنس المستهدف.
  3. استخدم MEGA11 لمحاذاة التسلسل ، وتحليل ومقارنة تباين التسلسل غير المحدد ومتعدد الأنواع ، وبناء شجرة مرتبطة بالجار والتطور.
    1. قم بتنزيل تسلسلات ثلاثة أنواع من حشيشة الملاك ونوع واحد من Peucedanum praeruptorum كمجموعة خارجية من NCBI. قم بتحليل هذه التسلسلات مع تسلسل النتائج الذي تم الحصول عليه.
    2. انقر فوق ملف، واختر فتح ملف/جلسة لاستيراد الملف، وسيظهر مربع حوار. اختر Align > DNA، وحدد Align by ClustalW لمقارنة التسلسل. اختر تحليل النشوء والتطور في البيانات ، ثم ارجع إلى الصفحة الرئيسية. انقر فوق إنشاء/اختبار شجرة الانضمام إلى الجار في PHYLOGENY. يولد البرنامج شجرة النشوء والتطور.

النتائج

عينة من جودة الحمض النووي

كان نطاق نسب امتصاص OD260 / OD280 1.80-1.84. كانت كمية الحمض النووي المقاسة بواسطة مقياس الطيف الضوئي لكل عينة أكبر من 100 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 3) ، مما يشير إلى جودة جيدة لاستخراج الحمض النووي للعينة. يشير هذا إلى أن ا?...

Discussion

تقنية التحديد الجزيئي أسهل في التعلم والإتقان من طرق تحديد الهوية التقليدية. يتغلب على قيود تحديد الأعشاب الطبية التقليدية ، حيث لا يتأثر بمرحلة نمو النبات ولا يعتمد على الحكم الذاتي أو تراكم الخبرات المتخصصة35. يتم الخلط بين الأنواع الأخرى و A. sinensis بسب...

Disclosures

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال تقديم مشروع دعم تمويل بدء البحث العلمي للشخص الموهوب لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (030040015).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MSuitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acidBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BAdoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEQuantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidoneShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice MakerShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue HomogenizerBeyotime Biotechnology. F6623Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath KettleShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.

References

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37 (2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723 (2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848 (2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237 (2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067 (2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803 (2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613 (2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651 (2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112 (2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526 (2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38 (2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728 (2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940 (2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958 (2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476 (2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771 (2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015 (2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833 (2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934 (2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ITS2 BLAST Clade

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved