A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

Abstract

يظل تحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد أثناء الصحة والمرض مفتاحا لتحسين فهمنا للفيزيولوجيا المرضية المناعية. تم تطوير التحديات التقنية لتتبع مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد داخل ذخيرة الخلايا التائية الداخلية بشكل كبير من خلال تطوير الببتيد: كواشف رباعي MHC. ترتبط هذه المتعددات القابلة للذوبان ذات العلامات الفلورية لجزيئات MHC من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواتم الببتيد المستضدية مباشرة بالخلايا التائية ذات خصوصية مستقبلات الخلايا التائية المقابلة (TCR) ، وبالتالي يمكنها تحديد مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في حالتها الأصلية دون الحاجة إلى استجابة وظيفية ناتجة عن خارج الجسم الحي التحفيز. بالنسبة للمجموعات النادرة للغاية ، يمكن إثراء الخلايا التائية المرتبطة برباعي مغناطيسيا لزيادة حساسية وموثوقية الكشف.

مع تعمق فحص مناعة الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة، هناك حاجة ملحة لتحديد الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد التي تنتقل إلى الأنسجة غير اللمفاوية وتعيش فيها. في هذا البروتوكول ، نقدم مجموعة مفصلة من التعليمات لعزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الموجودة داخل رئتي الفأر. يتضمن ذلك عزل الخلايا التائية من أنسجة الرئة المهضومة متبوعة بخطوة إثراء مغناطيسي عامة للخلايا التائية وتلطيخ رباعي لتحليل التدفق الخلوي وفرزه. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر ، وهي قابلة للتكيف بشكل كبير مع مجموعة متنوعة من التحليلات النهائية لأي مجموعة خلايا تائية منخفضة التردد خاصة بالمستضد موجودة داخل الرئتين.

Introduction

في قلب جهاز المناعة التكيفي تكمن قدرة الخلية التائية على التعرف على مولد ضد معين والاستجابة له. متى وأين تستجيب الخلية التائية لمستضدها المماثل يحدد توازن العدوى والمناعة الذاتية ، والتوازن والسرطان ، والصحة والمرض1. ويترتب على ذلك أن دراسة الخلايا التائية في سياق معين من المناعة يجب أن تركز على الخلايا ذات الخصوصية لمستضد ذي صلة ذات أهمية. من بين التطورات التكنولوجية التي عززت بشكل كبير القدرة على توصيف مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، توجد multimers القابلة للذوبان الموسومة بالفلورسنت (عادة رباعيات) لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواجز الببتيد المستضدية ، والمعروفة باسم "الببتي....

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وتطويرها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مستشفى ماساتشوستس العام ، وهو برنامج إدارة معتمد من الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر (AAALAC). أجريت التجارب على ذكور وإناث الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا على خلفية وراثية C57BL / 6 تم تربيتها والحفاظ عليها في منشأة MGH الحيوانية في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.

1. إعداد حلول الأسهم

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت HEPES عن طريق إذابة 10 mM HEPES و 5 mM KCl و 1.8 mM CaCl2 و 150 mM NaCl و 1 mM MgCl2 ، والتكيف مع الرقم الهيدروجيني 7.4.

النتائج

يوضح الشكل 2 استراتيجية البوابة التمثيلية المستخدمة في تحديد الخلايا التائية CD4 + النادرة الخاصة بالمستضد في الرئتين باستخدام الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الثانية. يمكن تطبيق نفس العملية على خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد مع الببتيد: رباعيات MHC من الفئة الأولى (البي?.......

Discussion

استفادت التوصيفات السابقة للخلايا التائية الخاصة بالمستضد من الرئتين من الأعداد القوية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد والتي تتوسع بعد حدث فتيلة حاد مثل التحصين داخل الأنف أو العدوى20،21،22. ومع ذلك ، يصعب اكتشاف مجموعات الخلايا التائية ?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

Acknowledgements

نشكر L. Kuhn على المساعدة الفنية في معالجة الأنسجة وإنتاج tetramer. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI107020 و P01 AI165072 إلى JM ، T32 AI007512 إلى D.S.S.) ، واتحاد ماساتشوستس حول الاستعداد لمسببات الأمراض (JJM) ، واللجنة التنفيذية للأبحاث في مستشفى ماساتشوستس العام (JM).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++Corning46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine Hemisulfate SaltSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, mouseMiltenyi130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)Miltenyi130-042-302Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Holds 4 LS columns
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automated tissue dissociator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)Miltenyi130-042-401Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium without L-glutamineCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

References

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved