التطورات في تكنولوجيا الكائنات العضوية البقرية باستخدام واجهات أحادية الطبقة المعوية الصغيرة والكبيرة

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد أحاديات 2D المعوية البقرية من المواد العضوية ، مما يوفر وصولا محسنا لدراسة تفاعلات المضيف والممرض. ويشمل طرقا لتقييم سلامة الغشاء ووظائفه ، وتطوير النماذج المختبرية التي تحاكي فسيولوجيا الجهاز الهضمي للماشية. ويعد هذا النهج بفوائد طبية حيوية وزراعية كبيرة، بما في ذلك تعزيز استراتيجيات العلاج.

Abstract

يعتمد تطوير المعرفة بفسيولوجيا الجهاز الهضمي وأمراضه بشكل حاسم على تطوير نماذج دقيقة ومحددة الأنواع في المختبر تحاكي بأمانة الأنسجة المعوية في الجسم الحي . هذا أمر حيوي بشكل خاص للتحقيق في التفاعلات بين المضيف والممرض في الأبقار ، والتي تعد مستودعات مهمة لمسببات الأمراض التي تشكل مخاطر خطيرة على الصحة العامة. توفر المواد العضوية التقليدية 3D وصولا محدودا إلى السطح القمي للظهارة المعوية ، وهي عقبة تغلب عليها ظهور ثقافات أحادية الطبقة 2D. توفر هذه الثقافات ، المشتقة من الخلايا العضوية ، سطحا لمعيا مكشوفا لدراسة يسهل الوصول إليها. في هذا البحث ، تم تقديم بروتوكول مفصل لإنشاء واستدامة ثقافات أحادية الطبقة 2D من خلايا الكائنات العضوية المعوية الصغيرة والكبيرة في الأبقار. تتضمن هذه الطريقة بروتوكولات لتقييم سلامة الغشاء من خلال المقاومة الكهربائية عبر الظهارة والنفاذية شبه الخلوية جنبا إلى جنب مع تقنيات تلطيخ الكيمياء المناعية. تضع هذه البروتوكولات الأساس لإنشاء وتوصيف نظام استزراع أحادي الطبقة 2D ، مما يدفع حدود تطبيقات هذه الطريقة في البحوث الطبية الحيوية والانتقالية ذات الأهمية الصحية العامة. يتيح استخدام هذا النهج المبتكر تطوير نماذج ذات صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لاستكشاف كل من الحالات الطبيعية والمريضة لفسيولوجيا أمعاء الماشية. إن الآثار المترتبة على التقدم الطبي الحيوي والزراعي عميقة ، مما يمهد الطريق لعلاجات أكثر فعالية للأمراض المعوية في الماشية ، وبالتالي تعزيز كل من رعاية وسلامة الأغذية.

Introduction

تمثل زراعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) ، والمعروفة باسم الكائنات العضوية المعوية ، تقدما كبيرا في التكنولوجيا في المختبر للتحقيق في وظائف الأمعاء والتغذية والتفاعلات مع مسببات الأمراض ^1,2. تحاكي هذه الكائنات العضوية البنية المعقدة لظهارة الأمعاء في الجسم الحي عن طريق التكرار الذاتي والتنظيم في تكوينات ثلاثية الأبعاد تشمل سلالات الخلايا المعوية^{المختلفة 3}. تسلط هذه الميزة الضوء على إمكاناتها الكبيرة لدفع فهم البيولوجيا المعوية إلى الأمام.

إن الاهتمام المتزايد بتطبيق تكنولوجيا العضويات المعوية على المزرعة يستلزم صقل تقنيات الاستزراع^{والصيانة 4,5}. يتم التأكيد على أهمية هذه التكنولوجيا من خلال تأثيرها المحتمل على دراسة صحة الأمعاء لحيوانات المزرعة ، والتي تلعب دورا حاسما في إنتاجيتها ، وبالتالي اقتصاديات صناعة الأغذية من خلال التأثير على رعاية والتكاليف التشغيلية ^6,7. على وجه التحديد ، فإن استخدام الثقافات العضوية المعوية لاستكشاف وظيفة الأمعاء للماشية له أهمية قصوى ، نظرا لدورها كخزانات لمسببات الأمراض المعوية الحيوانية المنشأ ، مثل السالمونيلا spp. و Escherichia coli (E. coli) O157: H7⁸. يتم توطين مسببات الأمراض هذه في أجزاء معينة من الأمعاء ، مما يجعل من الضروري التمييز بين طرق زراعة الأعضاء المعوية حسب شريحة الأمعاء لتعزيز الدقة في الدراسات⁹.

عقبة كبيرة في دراسة العضويات المعوية هي الوصول المقيد إلى السطح القمي للخلية الظهارية¹⁰. عند استزراعها داخل مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، توجه الخلايا نفسها بشكل طبيعي بحيث يواجه السطح القاعدي الخارج ، ويتم توجيه السطح القمي إلى الداخل¹⁰. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم الأساليب التي تنطوي على فصل المواد العضوية 3D إلى خلايا واحدة وزرعها في إدراج ثقافة الخلية شبه منفذة. ينشئ هذا الإعداد واجهة بين السطح القمي والمقصورة القاعدية. يوضح هذا البروتوكول أن الخلايا المشتقة من الكائنات العضوية المعوية البقرية يمكن أن تشكل طبقة أحادية 2D متماسكة ، كما يتضح من قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ومقايسات نفاذية الخلايا النظيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأكيد تطور القطبية الخلوية مع حدود الفرشاة والوصلات الضيقة في الخلايا أحادية الطبقة 2D المشتقة من العضوية من خلال التألق المناعي والمجهر الإلكتروني ، مما يعكس خصائص ظهارة الأمعاء في الجسم الحي .

في هذه الدراسة ، يمثل الدقاق القناة المعوية الدقيقة ، ويشير المستقيم إلى القناة المعوية الغليظة. تعتمد هذه الاختيارات على مسببات الأمراض المعوية ذات الصلة مثل السالمونيلا النيابة، والتي يمكن أن تنقل الدقاق¹¹، والإشريكية القولونية O157: H7 المعروفة باستعمار المستقيم⁹ في الماشية بشكل أساسي. يسلط اختيار هذه الأجزاء المعوية المحددة الضوء على ضرورة تكييف طرق زراعة الأعضاء المعوية مع منطقة الأمعاء من أجل الدقة في البحث. توضح هذه الطرق بالتفصيل الإجراء الخاص بزراعة واجهة أحادية الطبقة 2D مشتقة من الأعضاء بشكل فعال من هذه الأجزاء المعوية ، مما يوفر نموذجا قويا لاستكشاف صحة أمعاء الماشية ، والتهابات مسببات الأمراض ، والتفاعلات بين ميكروبيوم الأمعاء والمضيف.

Protocol

تم شراء الخبايا المعوية من العينات المعوية الفائضة التي تم الحصول عليها من مسلخ محلي ، وترد إشارات المتبرعين في الجدول التكميلي 1. تم إنشاء المواد العضوية باستخدام الأنسجة المشتقة من التي تم قتلها رحيما إنسانيا في المسلخ ، ولم يتم شراء فقط لهذا البحث. لذلك ، هذه الدراسة معفاة من مراجعة IACUC ، ولا ينطبق بيان الأخلاقيات.

1. طلاء ECM على إدراج ثقافة الخلية لثقافة أحادية الطبقة 2D المشتقة من الأعضاء

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مواد معقمة وتقنيات معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. يتم الاحتفاظ بجميع الكواشف على الجليد طوال الإجراء ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. قم بإعداد 100 ميكرولتر من ECM لطلاء كل 0.33 سم² إدراج ثقافة الخلية عن طريق خلط الوسط القاعدي مع 2٪ (v / v) هيدروجيل قائم على ECM في أنبوب دقيق تماما.
2. قم بإزالة ملحق زراعة الخلايا الفردية من العبوة باستخدام ملقط معقم وضعه بشكل فردي في آبار صفيحة زراعة الخلايا ذات القاع المسطح ذات 24 بئرا.
3. ضع 100 ميكرولتر من طلاء ECM المحضر في الخطوة 1.1 على الغرفة القمية لكل ملحق مزرعة خلية تم إعداده في الخطوة 1.2.
4. استبدل الغطاء واحتضان لوحة زراعة الخلايا التي تحتوي على إدراج (إدراجات) زراعة الخلايا المغلفة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 1 ساعة.
   1. بالنسبة للخلايا العضوية اللفائفية ، يكون الملحق جاهزا للاستخدام بعد حضانة 1 ساعة. بالنسبة للخلايا العضوية المستقيمية ، بعد حضانة 1 ساعة ، استبدل طلاء ECM بوسط استزراع أحادي الطبقة المستقيم واحتضانه طوال الليل (الجدول 1). قم بإعداد إدخالات إضافية لزراعة الخلايا لعناصر التحكم الفارغة إذا كان الغرض منها إجراء قياسات TEER.

	الدقاق	المستقيم
وقت حضانة طلاء ECM	1 ساعة	1 ساعة متبوعة ب بين عشية وضحاها في وسائط الثقافة أحادية الطبقة
المكملات الغذائية ل وسط الثقافة العضوية
		CHIR99021
	LY2157299	LY2157299
	Y-27632	Y-27632
	مصل الجنين البقري	مصل الجنين البقري
كثافة بذر الخلايا (خلايا / بئر)	5 س 105	3 س 105

الجدول 1: ملخص للبروتوكول الأمثل لإنشاء طبقات أحادية 2D مشتقة من عضويات اللفائفي والمستقيم البقري البالغة.

2. بذر الخلايا العضوية اللفائفية و / أو المستقيمية البذرية وثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد

ملاحظة: يستخدم البروتوكول الموصوف في هذا القسم عضويات اللفائفية والمستقيمية البقرية ، والتي تم استزراعها وصيانتها على 48 صفيحة بئر باستخدام التقنيات الموصوفة⁵. للحصول على أفضل النتائج ، ينصح باستخدام المواد العضوية التي تم الحفاظ عليها بثبات والتي تم تمريرها أكثر من 3x بعد التأسيس الأولي وتم استزراعها لأكثر من 3 أيام بعد آخر مرور.

1. دون إزعاج قبة هيدروجيل القائمة على ECM التي تحتوي على عضويات ناضجة ، قم بإزالة وسائط الاستزراع العضوية باستخدام ماصة باستور زجاجية يمكن التخلص منها متصلة بنظام تفريغ وإضافة 300 ميكرولتر من محلول إزالة بلمرة ECM المثلج البارد لكل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بتعطيل العضوي الذي يحتوي على قبة هيدروجيل قائمة على ECM ميكانيكيا بعد إضافة محلول إزالة البلمرة ECM وجمع التعليق في أنبوب مخروطي سعة 15 مل قبل الحضانة عند 4 درجات مئوية. يوصى بهذه الطريقة عندما يتم استزراع المواد العضوية التي لا يقصد استخدامها في ثقافة أحادية الطبقة 2D في وقت واحد على نفس اللوحة. تؤثر كثافة المزارع العضوية بشكل كبير على عدد آبار الاستزراع العضوي المطلوبة للبذر الأمثل لإدراج زراعة الخلايا.
   1. بالنسبة للمزارع العضوية عالية الكثافة (الشكل التكميلي 1 أ) ، تستخدم إدخالات زراعة الخلايا المستقيمة نسبة بذر في نطاق 1: 1 إلى 1: 2 ، مما يعني أن بئرا واحدا يمكن أن يزرع بئرا واحدا إلى بئرين. بالنسبة للدقاق ، حافظ على النسبة عند 1: 1. وعلى النقيض من ذلك، تتطلب المزارع منخفضة الكثافة (الشكل التكميلي 1 ب) المزيد من الآبار المستزرعة. استخدم 3-4 آبار استزراع عضوي مستقيمي لإدراج واحد لزراعة الخلايا الشرجية (نسبة 3-4: 1) ، و 4-5 آبار استزراع عضوي لفائفي واحد (نسبة 4-5: 1).
2. افحص بصريا الذوبان الكامل للهيدروجيل القائم على ECM واجمع التعليق العضوي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
3. عضويات الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية. إعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف المكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632.
4. احتضان معلق عضوي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع اهتزاز متقطع من 3-5 ثوان مع دوامة كل 2-3 دقائق لتسهيل التفكك العضوي الفعال.
5. بعد الهضم الأنزيمي ، أضف 5 مل من الوسط القاعدي والماصة بقوة باستخدام ماصة P1000 الدقيقة لزيادة تعطيل المواد العضوية إلى الخلايا المفردة. افحص التعليق بحثا عن كتل عضوية، وإذا كان لا يزال ملحوظا بصريا، كرر السحب لتعزيز تفكك الخلية الواحدة.
6. تحضير أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة خلية 70 ميكرومتر. بلل المصفاة عن طريق تطبيق 1-2 مل من الوسط القاعدي.
7. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال المصفاة لإزالة بقايا هيدروجيل القائمة على ECM وكتل الخلايا الكبيرة. شطف أنبوب 15 مل الأصلي ومصفاة خلية 70 ميكرومتر مع 10 مل إضافية من الوسط القاعدي.
   ملاحظة: إذا لم يمر تعليق الخلية بسهولة عبر مصفاة ، فقد يكون ذلك مؤشرا على تفكك عضوي غير مكتمل. يمكن محاولة إعادة تمرير تعليق الخلية المجمعة من خلال نفس مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. قد يكون من الضروري حدوث اضطراب إنزيمي أو ميكانيكي إضافي.
8. تعليق بيليه أحادي الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا ذات الحجم المناسب من الوسط القاعدي لإجراء عدد الخلايا.
9. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم بعد تلطيخ التريبان الأزرق لحساب العدد الإجمالي للخلايا التي تم جمعها.
10. تعليق بيليه أحادي الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا إلى كثافة البذر المناسبة في وسط الاستزراع أحادي الطبقة المعني (الجدول 1).
    1. بالنسبة للخلايا العضوية اللفائفية ، أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 2.5 × 10⁶ خلايا / مل لتحقيق كثافة بذر تبلغ 5 × 10⁵ خلايا لكل خلية يتم إدخالها في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع اللفائفي أحادي الطبقة ، وهو وسط الاستزراع العضوي المكمل ب 500 نانومتر LY2157299 و 10 ميكرومتر Y-27632 و 20٪ مصل بقري جنيني (FBS).
    2. بالنسبة للخلايا العضوية المستقيمية ، أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 1.5 × 10⁶ خلايا / مل لتحقيق كثافة بذر تبلغ 3 × 10⁵ خلايا لكل مزرعة خلية يتم إدخالها في 200 ميكرولتر من وسط زراعة المستقيم أحادي الطبقة ، وهو وسط الاستزراع العضوي المكمل ب 100 نانومتر CHIR99021 ، 500 نانومتر LY2157299 ، 10 ميكرومتر Y-27632 ، و 20٪ FBS.
11. استرجع لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا مع إدراج (إدراجات) زراعة الخلايا المغلفة ب ECM وأفرغ الغرفة القمية لإدخال زراعة الخلايا بشفط فراغ دقيق لعدم تعطيل الطلاء.
12. ضع برفق 200 ميكرولتر من معلق الخلية الواحدة المحضر في الخطوة 2.10 على الغرفة القمية لإدراج زراعة الخلية. بالنسبة لعنصر التحكم الفارغ ، أضف 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع بدون خلايا في الغرفة القمية. بالنسبة لعنصر التحكم الفارغ ، أضف 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع بدون خلايا في الغرفة القمية.
13. ضع 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع أحادي الطبقة المكمل بشكل مناسب (اعتمادا على الخلايا اللفائفية مقابل خلايا المستقيم) على الغرفة القاعدية لكل بئر.
14. احتضان في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لتسهيل التصاق الخلايا ونموها لتشكيل طبقة أحادية ثنائية الأبعاد متقاربة على إدخال زراعة الخلية.
15. تغيير وسائط الاستزراع في كل من الغرف القمية والقاعدية كل يوم بدءا من 48 ساعة بعد بذر الخلية. تأكد من وقت حضانة متساو لعنصر التحكم الفارغ والإدراج المحتوي على الخلية.

3. قياس TEER

ملاحظة: تستخدم الطريقة الموصوفة هنا نظام قياس TEER اليدوي المتاح تجاريا والمعروف باسم مقياس الفولتوم الظهاري مع زوج من أقطاب Ag / AgCl (الشكل 1A). يتطلب تحديد TEER عبر طبقة أحادية 2D قياس الآبار الفارغة. تأكد من أخذ القراءة الفارغة بنفس طريقة أخذ العينة.

1. استرجع اللوحة التي تحتوي على إدخالات ثقافة الخلية مع طبقة أحادية (طبقات) 2D مشتقة من العضوية وفارغة من الحاضنة. اترك اللوحة تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.
2. تطهير الأقطاب الكهربائية مع 70 ٪ من الإيثانول والسماح لهم ليجف تماما.
3. أدخل بعناية الأقطاب الكهربائية ذات النهاية القصيرة في الغرفة القمية والنهاية الطويلة في الغرفة القاعدية (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: هناك ما يبرر توخي الحذر الشديد حتى لا تعطل الخلية أحادية الطبقة.
4. اسمح للقراءة بالتوازن وتسجيل القيمة بالأوم عندما تستقر.
   ملاحظة: حساسية مقياس الفولتوم هي أن تقلبات قيمة أوم ستحدث أثناء أخذ قياس المقاومة الكهربائية. يتم الحصول على قراءة موثوقة عندما تستقر القياسات وتحوم باستمرار حول قيمة الهضبة.
5. حدد TEER أحادي الطبقة 2D بالصيغة التالية:
   TEER (Ω ×^{سم 2}) = مساحة سطح إدراج زراعة الخلايا (سم²) × المقاومة الكهربائية الصافية
   حيث المقاومة الكهربائية الصافية تساوي المقاومة المقاسة للخلية أحادية الطبقة ، أدخل مطروحا منه المقاومة المقاسة للإدراج الفارغ. تبلغ مساحة سطح إدراج زراعة الخلايا لألواح 24 بئرا 0.33 سم².

الشكل 1: تقييم سلامة الحاجز الظهاري للطبقة أحادية الطبقة 2D المشتقة من عضويات الأمعاء البقرية. (أ) رسم تخطيطي للموضع المناسب للأقطاب الكهربائية داخل الغرف القمية والقاعدية لإدراج مزرعة الخلية لقياسات TEER. يتم إدخال القطب القصير في الغرفة القمية ، ويتم وضع القطب الطويل في الغرفة القاعدية بعناية لتجنب ملامسة الغشاء. (ب) رسم تخطيطي لعملية فحص النفاذية. يتم غسل غرف زراعة الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ ، ويتم تطبيق 0.5 مجم / مل 4 كيلو دالتون FITC-dextran المقتفي المذاب في PBS على الغرفة القمية. يتم أخذ عينات متكررة من 50 ميكرولتر من الغرفة القاعدية مع استبدال حجم متساو من PBS للحفاظ على الحجم الكلي في الغرفة القاعدية طوال مدة فترة الحضانة. يتم قياس شدة مضان القسمة باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لتحديد انتشار 4 كيلو دالتون FITC-dextran المقتفي عبر الطبقة الأحادية للخلية. (ج) تم تقييم التطور الديناميكي لسلامة الحاجز داخل الطبقات الأحادية اللفائفية والمستقيمية بمرور الوقت باستخدام قياسات TEER (ممثلة بدوائر مغلقة للدقاق ومربعات مغلقة للمستقيم) ومقايسات النفاذية (يشار إليها بدوائر مفتوحة للدقاق ومربعات مفتوحة للمستقيم) مع متتبع 4 كيلو دالتون FITC-dextran. بحلول اليوم 3 من الثقافة ، أظهر كلا النوعين من الطبقات الأحادية إنشاء حواجز ظهارية مستقرة ووظيفية ، كما يتضح من ملفات تعريف TEER والنفاذية الخاصة بكل منهما. النتائج هي متوسط تجربتين مستقلتين على الأقل مع نسختين تقنيتين. تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث للقياسات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. مقايسة نفاذية الخلايا

ملاحظة: يتضمن هذا الفحص تحديد شدة التألق الناتجة عن انتشار الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) -ديكستران من الغرفة القمية إلى الغرفة القاعدية عبر أحاديات 2D على مدى 120 دقيقة (الشكل 1 ب). للحصول على أفضل النتائج ، ينصح بتقليل التعرض للضوء أثناء الفحص وأخذ القياسات في قارئ الصفائح الدقيقة مباشرة بعد كل عينة لمنع أي انخفاض أو إخماد للتألق. يمكن استخدام كل بئر مرة واحدة فقط ولا يمكن إعادة استخدامها في المقايسات اللاحقة. إعداد ما لا يقل عن 2 آبار لتكون بمثابة النسخ المتماثلة التقنية لكل فحص. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى ما مجموعه 6 آبار للحصول على النتائج المعروضة في الشكل 1C ، حيث تم إجراء المقايسات في نسختين في 3 نقاط زمنية مختلفة (الأيام 1 و 3 و 5 من الثقافة).

1. تحضير سلسلة تخفيف المنحنى القياسية مع 4 كيلو دالتون FITC-dextran في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). لكل تخفيف ، ماصة 50 ميكرولتر إلى لوحة 96 بئر في ثلاث نسخ.
   ملاحظة: يوصى بإنشاء سلسلة من 5-7 تخفيفات تتراوح من 0 إلى 0.5 مجم / مل.
2. تحديد شدة التألق للمعايير في قارئ صفيحة مجهرية تمت معايرته مسبقا بطول موجة إثارة يبلغ 495 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 535 نانومتر.
3. احسب الانحدار الخطي مع نتائج شدة التألق لإنشاء منحنى قياسي.
4. استرجع اللوحة التي تحتوي على إدخالات ثقافة الخلية مع طبقة أحادية (طبقات) 2D مشتقة من العضوي من الحاضنة. قم بإزالة وسائط الاستزراع أحادية الطبقة من الغرفة القمية والقاعدية لإدراج ثقافة الخلية الذي يحتوي على الطبقة الأحادية 2D المشتقة من العضوية ليتم تقييمها.
5. اغسل كل غرفة برفق 2x مع 200 ميكرولتر (غرفة قمي) و 500 ميكرولتر (غرفة قاعدية) من PBS قبل التسخين ، على التوالي.
6. قم بإزالة محلول الغسيل من الحجرة القمية وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل 4 كيلو دالتون FITC-dextran المقتفي في PBS على الغرفة القمية لإدخال زراعة الخلايا.
7. احتضان في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 20 دقيقة.
8. عينة 50 ميكرولتر من الغرفة القاعدية للوحة المحتضنة المكونة من 24 بئرا ونقلها إلى صفيحة 96 بئر متوافقة مع قارئ الصفيحة الدقيقة.
9. استبدل 50 ميكرولتر من PBS الطازج في الغرفة القاعدية للبئر الذي تم أخذ عينات منه.
10. خذ على الفور قياس شدة التألق في قارئ صفيحة مجهرية تمت معايرته مسبقا بطول موجة إثارة يبلغ 495 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 535 نانومتر.
11. كرر الخطوات 4.6-4.10 كل 20 دقيقة حتى 120 دقيقة. في نهاية الفحص ، إذا كان الحفاظ على الطبقة الأحادية ثنائية الأبعاد مطلوبا ، اشطف كل من الغرفة القمية والقاعدية باستخدام PBS 2x جديد ، واستبدله بوسط ثقافة أحادي الطبقة جديد ، واحتضن.
    ملاحظة: يمكن إجراء مزيد من التقييم للطبقات الأحادية 2D ، أي قياسات TEER ، تلطيخ التألق المناعي ، وما إلى ذلك ؛ ومع ذلك ، لا يوصى به لأن المقتفي الفلوري المتبقي محتمل وقد يؤثر على التحليل.
12. حدد معامل النفاذية الظاهري (P_app) بالصيغة التالية:
    
    ΔQ / Δt = تركيز المقتفي الفلوري الذي مرر الطبقة الأحادية إلى الغرفة القاعدية لإدخال زراعة الخلية خلال فترة زمنية محددة ، مقاسا بكثافة التألق واستقراء إلى ميكروغرام / مل عبر المنحنى القياسي
    A = مساحة سطح إدراج ثقافة الخلية
    C_o = تركيز المقتفي الفلوري المضاف إلى الغرفة القمية لإدراج مزرعة الخلية في ميكروغرام / مل

5. تلطيخ المناعي للطبقة الأحادية 2D المشتقة من الأعضاء

1. قم بإزالة وسائط الاستزراع أحادية الطبقة من إدخال زراعة الخلايا بالشفط الفراغي وأضف 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة لتثبيت الخلية.
2. قم بإزالة PFA بشفط الفراغ واغسله ب 100 ميكرولتر من PBS 2x.
3. تتخلل الخلايا مع 100 ميكرولتر من 0.3٪ Triton X-100 في 2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
4. قم بإزالة المادة الطافية بشفط الفراغ واغسلها ب 100 ميكرولتر من PBS 2x.
5. إزالة طاف واستبدالها مع 2 ٪ BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة للحجب.
6. إزالة المادة الطافية ، وتطبيق 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف في 2 ٪ BSA في PBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تركيزات الأجسام المضادة الأولية المستخدمة موجودة في جدول المواد. ما لم يتم تحديد ذلك ، يتم اتباع توصيات الشركة المصنعة.
7. إزالة طاف ويغسل مع 100 ميكرولتر من PBS 3x.
8. ضع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 2٪ BSA في PBS واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان الجسم المضاد الأساسي المستخدم مقترنا بمسبار مضان. تركيزات الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة موجودة في جدول المواد. ما لم يتم تحديد ذلك ، يتم اتباع توصيات الشركة المصنعة.
9. إزالة طاف ويغسل مع 100 ميكرولتر من PBS 3x.
10. اختياري: للتلوين المضاد ل F-actin والنوى (DAPI) ، قم بالتحضير عن طريق خلط كلا المجسين بتخفيف مناسب (حسب توصية الشركة المصنعة) في PBS ، ضع 100 ميكرولتر ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إزالة طاف ويغسل مع 100 ميكرولتر من PBS 3x.
11. قطع بعناية ثقافة الخلية إدراج الغشاء مع شفرة مشرط ، وجبل على شريحة زجاجية مع حل التركيب. ضع زلة غطاء وراقبها.

النتائج

يولد هذا البروتوكول بشكل موثوق طبقات 2D 2D مشتقة من الأمعاء البحرية القوية من الأمعاء الدقيقة والكبيرة ، مما يحاكي تعقيد ظهارة الأمعاء في الجسم الحي . تستخدم هذه الطريقة عضويات ناضجة تم تطويرها من عينات سرداب معوية من ماشية صحية مستزرعة بظروف مثلى. ومن المثير للاهتمام ، أن الظروف الناجحة والقابلة للتكرار للطبقات أحادية 2D المشتقة من العضوية فريدة من نوعها في جزء القناة الهضمية (الجدول 1). هذا يعزز أهمية وجود تقنيات استزراع محسنة لشريحة القناة الهضمية ذات الاهتمام.

في يوم واحد بعد بذر الكائنات العضوية الناضجة المنفصلة على إدراج ثقافة الخلية ، بدا أن طبقة أحادية ثنائية الأبعاد تتشكل (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، على الرغم من هذا المظهر الأولي ، ظلت قياسات TEER لكل من الطبقات الأحادية اللفائفية والمستقيمية منخفضة في هذه المرحلة (الشكل 1C). علاوة على ذلك ، كشف فحص نفاذية الخلايا أن الطبقة الأحادية ، بعد يوم واحد فقط من الثقافة ، سمحت بمرور متتبع 4 كيلو دالتون FITC-dextran عبر طبقة الخلية (الشكل 1C). بحلول^{اليوم الثالث} من الثقافة ، أظهر كلا النوعين من أحاديات 2D المشتقة من المواد العضوية نضجا كبيرا ، كما يتضح من زيادة قيم TEER ومقاومة متتبع 4 kDa FITC-dextran ، وهو اتجاه استمر حتى اليوم 5 من الثقافة.

وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى التباين بين الأنواع ، حيث على الرغم من انخفاض قيم TEER للثقافات أحادية الطبقة 2D المشتقة من الكائنات العضوية البقرية بالنسبة إلى نظرائهم من البشر في ظل ظروف مماثلة^{12،13،14،15} ، تظل سلامة الغشاء سليمة. هذا الاستنتاج مستمد من الاستجابة المناسبة للطبقة الأحادية في مقايسات النفاذية ، مما يشير إلى أن قيم TEER المنخفضة في عينات الأبقار لا تعكس بالضرورة نقصا في وظيفة الحاجز. هذه السلامة ضرورية للحاجز الظهاري الوظيفي ويتم إثباتها بشكل فعال من خلال التفسير الدقيق لنتائج فحص النفاذية جنبا إلى جنب مع قياسات TEER.

إن تصور الترسيم الخلوي والزغابات الدقيقة المتطورة على السطح القمي للطبقات أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، وعرض الهياكل التشريحية الدقيقة المتخصصة ، عزز النضج لكل من الطبقات أحادية الأبعاد المشتقة من اللفائفي والمستقيمي (الشكل 2 ب). بالإضافة إلى ذلك ، أكد تلطيخ التألق المناعي للطبقات أحادية 2D وجود حدود الفرشاة القمية ، وتقاطعات الالتصاق القاعدية ، وخلايا الكأس المنتجة للمخاط في كل من الطبقات أحادية الأبعاد المشتقة من اللفائفي (الشكل 3 أ) والمستقيم (الشكل 3 ب). تعزز هذه النتائج أن الطبقة الأحادية 2D المطورة معقدة في التكوين والتكوين ، ولا تعبر فقط عن السمات الرئيسية لظهارة معوية سليمة ولكنها تتألف من مجموعة خلوية متعددة السلالات.

يعتمد تطوير 2D أحادي الطبقة الناجح على التزام الخلايا ب ECM والنمو عند الالتقاء لإنشاء طبقة ظهارية سليمة. والجدير بالذكر أن التوزيع غير المتكافئ ل ECM أو الظروف دون المستوى الأمثل أثناء الحضانة على ملحق زراعة الخلية يمكن أن يؤدي إلى انفصال جزئي لطبقة الخلية ، خاصة على طول حوافها (الشكل 4Ai). تتفاقم هذه المشكلة بشكل أكبر إذا تم زرع الخلايا بكثافة أعلى من الكثافة المثلى أو لم يتم توزيع خلايا البذر بالتساوي عبر سطح المزرعة ، وهو سيناريو غالبا ما ينبع من التفكك غير الكامل للعضويات إلى تعليق خلية واحدة. يمكن أن يؤدي هذا التوزيع غير المتكافئ إلى تكوين فجوات داخل الطبقة الأحادية و / أو التشكل ثلاثي الأبعاد على إدراج ثقافة الخلية (الشكل 4Aii). في المقابل ، يمكن أن يؤدي نقص البذر للخلايا أيضا إلى تطور أحادي الطبقة غير ناجح أو متأخر خلال فترة الاستزراع المتوقعة ، مما يؤثر عن غير قصد على كفاءة الدراسات اللاحقة باستخدام نظام 2D أحادي الطبقة (الشكل 4Aiii). علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تلوث نظام الاستزراع أيضا إلى تكوين فجوات داخل الطبقة الأحادية ، مما يؤدي إلى تعطيل الطبقة الأحادية المتقاربة التي تشكلت مرة واحدة في مرحلة لاحقة من الثقافة (الشكل 4Aiv). يمكن أن تتأثر قيم TEER المستدامة واستجابة نفاذية الخلايا بالاضطرابات في طبقة الخلية من تقنيات الغسيل أو المناولة العدوانية ، حتى عندما لا تتم مواجهة الأسباب المحتملة للفشل المذكورة أعلاه قبل هذه المقايسات (الشكل 4B). وبالتالي ، فإن المعالجة الدقيقة للخلايا وتقييم تكوين الطبقة الأحادية أو الاضطرابات أمر بالغ الأهمية للتطوير الناجح للطبقات الأحادية 2D المشتقة من العضوية من خلال التطبيق الفعال لاستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

الشكل 2: التوصيف المجهري للطبقات أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد المشتقة من اللفائفي البقري والمستقيمي. (أ) صور مجهرية تباينية تمثيلية للطور أحادي الطبقة ثنائية الأبعاد في اليوم 1 واليوم 3 (D1 و D3) من المزرعة على ملحق زراعة الخلية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) صور مجهرية إلكترونية تمثيلية المسح الضوئي لطبقات أحادية 2D مع تكبير أقل (يسار) وأعلى (يمين). يمكن تقدير بنية سطح الخلية التفصيلية ، بما في ذلك الزغابات الدقيقة ، في كل من الطبقات الأحادية اللفائفية (العلوية) والمستقيمية (السفلية). شريط المقياس الأيسر = 10 ميكرومتر ، شريط المقياس الأيمن = 2 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: توصيف التألق المناعي للطبقات أحادية 2D المشتقة من العضويات اللفائفية والمستقيمية. (أ، ب) توضح اللوحة (أ) اللفائفي، وتوضح اللوحة (ب) عضويات المستقيم. على اليسار ، يتم تمييز ألياف F-actin ب Phalloidin (أحمر) ، مما يوضح بنية الهيكل الخلوي وتشكيل حدود الفرشاة القمية. تلتقط الصورة الوسطى التوطين القاعدي لتقاطعات adherens ، المميزة ب E-cadherin (الأخضر) ، مما يدل على التصاق الخلية الخلوية وسلامة الطبقة الواحدة. على اليمين ، يتم تحديد وجود خلايا الكأس المنتجة للميوسين بواسطة SNA (أخضر) ، مع صورة z-stack تصور الإفراز القمي للموسين في الطبقة الأحادية اللفائفية. تم تلطيخ النوى عبر جميع الصور ب DAPI (أزرق). بالإضافة إلى ذلك ، يوضح التصوير z-stack عبر جميع الصور تكوين طبقة خلية واحدة داخل ملحق الثقافة. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: توصيف تشكيل أحادي الطبقة 2D دون المستوى الأمثل. (أ) صور تباين الطور التمثيلية التي توضح (i) الانفصال الجزئي للطبقة الأحادية على طول حافة إدخال زراعة الخلايا ؛ (ii) تطوير نمو 3D وتشكيل فجوات داخل الطبقة الأحادية ؛ (iii) تكوين أحادي الطبقة غير مكتمل أو متأخر بسبب كثافة البذر الأقل من الأمثل التي يشار إليها على أنها التصاق غير مكتمل للخلايا ؛ و (iv) تشكيل فجوات داخل الطبقة الأحادية 2D التي تم تشكيلها مرة واحدة في مرحلة لاحقة ، ومن المحتمل أن تكون ناتجة عن التلوث المشتبه به. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) يشير انخفاض قياسات TEER إلى جانب ارتفاع ملامح النفاذية بعد اليوم 3 إلى الفشل في إنشاء حواجز ظهارية مستقرة ووظيفية. يتم تقديم النتائج كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) من تجربة واحدة مع نسختين تقنيتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: اختلافات الكثافة في مزارع الأعضاء المعوية البقرية في هيدروجيل قائم على ECM. عضويات معوية بقري مستزرعة في هيدروجيل قائم على ECM ؛ أ: الكثافة العالية، ب: الكثافة المنخفضة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: إشارات المتبرعين بالأنسجة الملخصة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تعتبر صحة الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لكل من الإنتاجية والرفاه العام للماشية¹⁶. من خلال الاستفادة من تقنية 2D أحادية الطبقة المشتقة من المواد العضوية ، يمكن للعلماء الآن محاكاة البنية المعقدة لظهارة الأمعاء البقرية بدقة أكبر ضمن إعداد^{في المختبر 5}. لا يعيد هذا النهج المبتكر إنتاج التركيب الخلوي المتنوع لبطانة الأمعاء فحسب ، بما في ذلك أنسابها متعددة الخلايا فحسب ، بل يلتقط أيضا الخصائص الوظيفية الرئيسية ، مثل إفراز المخاط ووجود الزغابات الدقيقة ، وهي ضرورية لفهم فسيولوجيا الأمعاء وعلم الأمراض³. أدى تطوير بروتوكولات الاستزراع المصممة خصيصا لأجزاء من الدقاق والمستقيم إلى ظهور منصة متقدمة تعزز بشكل كبير القدرة على دراسة صحة الأمعاء الأبقارية. يتيح هذا النهج المتطور إجراء تحقيقات مفصلة في التفاعلات بين مسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والبيئة المعوية للأبقار. تعد القدرة على تكرار ودراسة الجوانب الفريدة للنظام البيئي المعوي البقري في المختبر خطوة مهمة نحو تطوير استراتيجيات مستهدفة لتحسين صحة الماشية والتخفيف من انتشار الأمراض الحيوانية المصدر.

ومع ذلك ، لضمان تطوير أحادي الطبقة 2D بنجاح باستخدام عضويات معوية بقري ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة وحيوية كل من الكائنات العضوية وخلاياها المفردة المنفصلة. يعد التعامل الدقيق وتقليل الإجهاد أمرا بالغ الأهمية في الحفاظ على سلامة الخلية ووظائفها ، والتي تعتبر ضرورية للنمو الفعال للعضويات والإنشاء اللاحق لطبقة أحادية تعمل لاحقا. علاوة على ذلك ، يعتمد تحقيق طبقة أحادية موحدة على التفكك الناجح للعضويات إلى خلايا مفردة دون تكوين كتل كبيرة. يمكن لمثل هذه الكتل أن تعطل توزيع الخلايا وتعرض بنية الطبقة الأحادية للخطر. لذلك ، فإن استخدام تقنيات دقيقة للتفكك السلس أمر بالغ الأهمية ، مما يؤدي إلى تعليق ثابت أحادي الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يصبح تقليل الاضطرابات أثناء التصاق الخلايا وعند غسل الخلايا الزائدة غير الملتصقة مفيدا. هذا النهج مهم بشكل خاص لمعالجة القضايا المحتملة مع مورفجينيسيس 3D ، وبالتالي تعزيز الجودة الشاملة للطبقة الأحادية.

ومن التحديات الملحوظة مع الهلاميات المائية القائمة على إدارة المحتوى في المؤسسة والتي هي من أصل بيولوجي التباين من دفعة إلى أخرى في التركيب¹⁷. في حين لم يلاحظ ذلك باستخدام البروتوكولات والمواد الموصوفة ، فإن الاختلافات من دفعة إلى أخرى في تكوين ECM يمكن أن تشكل تحديات أمام التطوير الأحادي الطبقة الناجح. إذا تم اختراق تكوين أحادي الطبقة عند تغيير منتجات ECM أو العلامات التجارية أو أرقام اللوت ، فقد تكون خطوات التحسين ضرورية لتحديد تركيز ECM المناسب المطلوب لطلاء إدخالات زراعة الخلية.

علاوة على ذلك ، يعد ضبط وسط المزرعة إلى درجة حرارة الغرفة قبل إجراء أي تغييرات خطوة حاسمة تساعد على تخفيف الصدمات الحرارية وحماية صحة الخلايا والحفاظ على جودة كل من الثقافات العضوية وأحادية الطبقة. تعتبر ممارسات الغسيل اللطيف ذات أهمية قصوى أيضا في الحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية أثناء تكوينها والمقايسات اللاحقة ، وتجنب الاضطرابات يمكن أن يمنع عدم الدقة في النتائج. بدا استبدال PBS بمحلول الملح المتوازن (HBSS) من هانك مفيدا في تقليل انفصال الطبقة الأحادية عندما أصبح مشكلة أثناء الغسيل المتكرر أو التعرض لفترات طويلة ل PBS ، كما هو الحال في مقايسات نفاذية الخلايا النظيرة. أخيرا ، يعد تصميم وسط المزرعة لتلبية الاحتياجات المحددة للخلايا من أجزاء مختلفة من الأمعاء ، مثل الدقاق والمستقيم ، أمرا ضروريا للتكرار بدقة في ظروف الجسم الحي . تضمن هذه الخصوصية صحة الخلية ووظائفها المثلى ، مما يسهل النمذجة الدقيقة لفسيولوجيا أمعاء الماشية والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، وبالتالي تسليط الضوء على هذه الخطوات الحاسمة في أبحاث الكائنات العضوية.

إلى جانب استخدام ممارسة التعامل اللطيف مع الخلايا ، فإن بناء الكفاءة التقنية الجيدة المرتبطة بحساب الخلايا وقياسات TEER أمر بالغ الأهمية للتطوير الناجح لطبقة أحادية 2D فعالة. نظرا لأن كثافات البذر المنخفضة جدا والعالية جدا الناتجة عن الإفراط في العد أو النقص في عدد الخلايا ، على التوالي ، يمكن أن تؤدي إلى نمو أحادي الطبقة معرض. يتم تشجيعه على مراجعة عدد الخلايا بعناية وضمان كثافة البذر المناسبة في الحالات التي يشتبه فيها في كثافات بذر غير دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي تقنيات قياس TEER غير الكافية إلى تعطيل الطبقة الأحادية عن طريق الخدوش غير المقصودة مع الأقطاب الكهربائية. يمكن أن يساعد إدخال الأقطاب الكهربائية بعناية إلى الغرفة القمية وإيلاء اهتمام خاص للحفاظ على اتجاهها الرأسي بالنسبة لسطح الغشاء في التخفيف من مخاطر التلف العرضي للطبقة الأحادية.

تم تكييف طرق مقايسة نفاذية الخلايا الموصوفة هنا من بروتوكول سابق¹⁸. يتم إجراء تعديلات على البروتوكول المبلغ عنه ، والتي تشمل أخذ عينات متعددة على مدى 120 دقيقة واستبدال الحصة المأخوذة بكميات متساوية من PBS ، لتحسين دقة النتائج وموثوقيتها. يعد الحفاظ على الحجم الكلي داخل الغرفة أمرا بالغ الأهمية لعدة أسباب: فهو يحافظ على التوازن التناضحي ، ويضمن سلامة الخلية ، ويحافظ على تدرج التركيز الضروري لتقييم النفاذية بدقة ، ويمنع التغيرات في الضغط الهيدروستاتيكي التي يمكن أن تؤثر على معدلات النقل. هذه الممارسة المتمثلة في تجديد الغرفة القاعدية ب PBS جديد مكافئ لحجم عينة PBS المحتوية على مادة التتبع الفلورية أمر محوري للحفاظ على هذه الظروف ، مما يتيح إجراء تقييمات دقيقة وذات مغزى لنفاذية الطبقة الواحدة. يعمل اختبار نفاذية الخلايا كمكمل لقياس TEER من خلال تقييم حركة جزيئات التتبع عبر الطبقة الأحادية مباشرة. علاوة على ذلك ، قد لا تسفر مقارنة قيم TEER عبر المختبرات المختلفة عن رؤى ذات صلة ، حيث يمكن أن تتأثر هذه القيم بالعديد من المتغيرات ، مثل درجة الحرارة والظروف المحددة التي يتم فيها زراعة الخلايا ، بما في ذلك أنواع الخلايا وأرقام المرور وتكوين وسط الاستزراع¹⁹. يوفر اختبار نفاذية الخلايا تقييما وظيفيا في المختبر للتعبير الفعال عن الالتصاقات والوصلات الضيقة داخل الحاجز الظهاري²⁰.

في حين أن تطوير أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد يمثل تقدما كبيرا في تكنولوجيا الاستزراع ، فمن المهم الاعتراف بالقيود المرتبطة بالطبقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. أحد العيوب الرئيسية هو أن هذا لا يزال نظام استزراع ثابت ، يفتقر إلى التحفيز الديناميكي الموجود في البيئة في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يمثل تعديل محتوى الأكسجين داخل نظام الاستزراع تحديات بسبب إعداده المفتوح الذي يتضمن لوحات استزراع ذات أغطية ، مما يجعله أقل ملاءمة للاستزراع المشترك طويل الأمد مع البكتيريا اللاهوائية. يمكن معالجة هذه القيود من خلال اعتماد منصات استزراع أكثر ديناميكية ، مثل أنظمة الموائع الدقيقة²¹ ، والتي توفر بيئة أكثر تحكما وذات صلة من الناحية الفسيولوجية. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان أن ندرك أنه في حين أن ظروف الاستزراع الحالية غنية بالعناصر الغذائية المفيدة للحفاظ على نمو الخلايا الجذعية ، إلا أنها قد لا تكون مثالية لإحداث تمايز فسيولوجي للخلايا الظهارية. يسلط هذا التناقض الضوء على الحاجة إلى التحسين في الأبحاث المستقبلية لمحاكاة الظروف في الجسم الحي عن كثب ودعم عملية التمايز. من خلال معالجة هذه القيود وتحسين هذه الأساليب ، يتم تعزيز فائدة وإمكانية تطبيق تقنيات الزراعة العضوية ، والاقتراب من تكرار الديناميات والتفاعلات المعقدة للجهاز الهضمي في المختبر.

يوفر بروتوكول توليد أحاديات الطبقات 2D من الأنسجة اللفائفية والمستقيمية البقري للباحثين نموذجا قيما في المختبر للواجهة اللمعية لكل من ظهارة الأمعاء الصغيرة والكبيرة. يفتح هذا النموذج إمكانيات واسعة للتطبيق في دراسات التغذية الحيوانية الأساسية ، لا سيما في فحص كيفية امتصاص العناصر الغذائية في ظل ظروف مختلفة. أحد مجالات الاهتمام البارزة هو التحقيق في متلازمة الأمعاء المتسربة ، التي تتميز بزيادة غير طبيعية في نفاذية الجهاز الهضمي ، وغالبا ما تنجم عن التحولات الغذائية ودرجات الحرارة البيئية القصوى^22,23. علاوة على ذلك ، يعمل هذا النموذج كأداة أساسية لاستكشاف التفاعلات المعقدة بين ميكروبيوم الأمعاء ومضيفه. يسمح بدراسة كيفية تأثير الكائنات الحية الدقيقة المتعايشة على صحة الكائن الحي المضيف ، ومعالجة جانب حاسم من العلوم البيطرية والطبية^1،24. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما توجد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية البشرية كمتعايشات في قطاعات مختلفة من أمعاء الماشية^8،9،25 ، يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات مفصلة للظروف المحددة التي تسمح لهذه العوامل الحيوانية المنشأ بالازدهار في مجالات تخصصها.

خلال هذه الدراسة ، لوحظ أن الطبقات الأحادية المشتقة من المستقيم واللفائفي تتطلب ظروفا مختلفة للتطور الناجح. على وجه التحديد ، عندما تم زرع الطبقات الأحادية العضوية المشتقة من المستقيم في البداية على إدخالات زراعة الخلايا المحضرة بهيدروجيل قائم على ECM بنسبة 2٪ في الوسائط القاعدية لمدة 1 ساعة ، لوحظت ثقوب كبيرة وتقشير الخلايا. تم حل هذه المشكلة عن طريق التحول إلى وسط زراعة أحادي الطبقة المستقيم المتخصص وتمديد فترة الحضانة إلى ليلة واحدة قبل البذر ، في حين تم تطوير أحاديات الطبقة المشتقة من العضوية اللفائفية بنجاح باستخدام بروتوكول تحضير أقصر. علاوة على ذلك ، أدت إضافة CHIR99021 إلى وسط الاستزراع باستمرار إلى تحسين إنشاء أحاديات المستقيم²⁶ ولكنها لم تكن ضرورية للطبقات الأحادية اللفائفية²⁷. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الطبقات الأحادية اللفائفية كثافة خلايا أعلى للتطور الناجح مقارنة بعضويات المستقيم²⁷. طورت هذه الظروف المحسنة (الجدول 1) بشكل متكرر طبقات أحادية تحافظ على سلامة الحاجز المقاوم ، مما يؤكد أهمية تكييف ظروف الاستزراع مع قطاع الأمعاء المحدد.

يعد الوصول إلى نموذج يعكس بدقة تعقيد النسب متعدد الخلايا للأمعاء في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لهذه التحقيقات. يسمح للباحثين بمحاكاة الظروف الطبيعية لبيئة الأمعاء عن كثب ، مما يوفر أساسا أكثر موثوقية للتجارب. مع هذا البروتوكول ، تم تجهيز الباحثين بنموذج قوي يعزز قدراتهم البحثية ، مما قد يؤدي إلى اكتشافات رائدة في مجالات دراستهم. لا يساهم هذا النهج في فهم صحة الأمعاء والأمراض فحسب ، بل يساعد أيضا في تطوير استراتيجيات لتحسين إدارة الثروة الحيوانية وسلامة الأغذية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X)	Gibco	12634-010	n/a
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061	2 mM
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	10 mM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016	1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01	Sigma-Aldrich	SML0788-5MG	500 nM
B27 Supplement (50X)	Gibco	17504-001	1X
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145-.5MG	10 nM
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG	50 ng/mL
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG	100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine	MP Biomedicals	194603	1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X)	R&D Systems	AR009	1X
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	10 mM
Noggin Conditioned Medium	n/a	n/a	10 vol/vol %
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium	n/a	n/a	20 vol/vol %
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-25MG	10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046-5MG	2.5 µM
HI FBS	Gibco	10438-034	20 vol/vol %
LY2157299	Sigma-Aldrich	SML2851-5MG	500 nM
Y-27632	StemCellTechnologies	72308	10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin	BD Biosciences	560061	1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	1:400 dilution
BSA	Cytiva	SH30574.02	2 w/vol %
Cell Recovery Solution	Corning	354253	n/a
DAPI Solution (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	1:1000 dilution
DPBS (1X)	Gibco	14190-144	n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	FD4-100MG	0.5 mg/mL
Matrigel Matrix	Corning	354234	n/a
Paraformaldehyde Solution (4%)	Thermo Scientific	J19943K2	n/a
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	n/a
SNA, EBL, Fluorescein	Vector Laboratories	FL-1301	1:100 dilution
Triton X-100	Thermo Scientific	A16046.AE	0.3 vol/vol %
TrypLE Express	Gibco	12605-028	n/a
Trypan Blue Solution, 0.4%	VWR Life Science	K940-100ML	n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert	Falcon	353095
24-well Cell Culture Plate	Corning	3524
48-well Cell Culture Plate	Thermo Scientific	150687
70 µm Sterile Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-One	655086
Centrifuge	Eppendorf	5910Ri
CO2 Incubator	Thermo Scientific	370
Epithelial Volt-Ohm Meter	Millipore	Millicell ERS-2
Hemocytometer	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope	Leica Microsystems	SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope	Leica Microsystems	DMi1
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-540-B
Microplate Reader	Molecular Devices	SpecrtraMax i3x
Microscope Slides	Fisher Scientific	22-034-486
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
Scalpel Blade	iMed Scientific	-	#11 carbon steel
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236
Software
LAS X imaging software	Leica Microsystems	LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software	Molecular Devces	SoftMax Pro 7.1.2