JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نظهر أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يثير بشكل فعال Hoechst 33342 ويعمل كبديل قابل للتطبيق لليزر 355 نانومتر لاكتشاف خلايا السكان الجانبية (SP) ، وبالتالي توسيع نطاق الليزر المتاح في تطبيقات قياس التدفق الخلوي.

Abstract

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). يتم استخدام طريقة Hoechst SP لعزل الخلايا الجذعية بناء على خصائص تدفق الصبغة لناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC). تم استخدام هذه الطريقة في البداية لتحديد وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، لكنها تطورت الآن للتركيز بشكل أساسي على تحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs). تستخدم طريقة الكشف التقليدية ل FCM ليزر 355 نانومتر لإثارة الصبغة للكشف عن خلايا SP. من خلال هذه الدراسة ، نجحنا في تحديد طرق بديلة لإثارة الصبغة التي يمكن أن تحل محل اكتشاف خلايا SP بشكل فعال باستخدام ليزر 355 نانومتر. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام ليزر 375 نانومتر أو 405 نانومتر عالي الطاقة. هذا يسمح لنا بممارسة انتقائية معززة في الكشف عن خلايا SP بدلا من أن تقتصر فقط على قياس التدفق الخلوي بالليزر 355 نانومتر.

Introduction

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). تتميز خلايا SP بضخ صبغة الحمض النووي الفلورية خارج الخلايا من خلال ناقل الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) 1,2. تم إنشاء هذه الطريقة في الأصل لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع عظم الفئران (HSCs) 1. تم إثراء خلايا نخاع العظم SP بمجموعة من HSCs تتميزبتعبير منخفض CD117 + Sca-1 + Lin-Thy1 3,4. بعد ذلك ، تم استخدام الطريقة على نطاق واسع لعزل وإثراء الخلايا الجذعية من الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك عضلة القلب5 والكبد6 والرئة7 والكلى8 والدماغ الأمامي9. على وجه الخصوص ، تم تطبيق الطريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في العقد الماضي. تمثل الخلايا الجذعية السرطانية مجموعة صغيرة من الخلايا التي تمتلك خصائص بدء الورم ، والتجديد الذاتي ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والإمكانات النقيلية10. تم تحديد الخلايا الجذعية السرطانية في البداية في الأورام الخبيثة المكونة للدم11 ولوحظت لاحقا في أورام صلبة مختلفة مثل سرطان البروستاتا12 والمبيض13 والمعدة14 والثدي15 والرئة16. على الرغم من توفر تقنيات مختلفة لتحديد CSC ، تظل تقنية SP خيارا مفضلا نظرا لتطبيقها الواسع عبر الأنسجة وخطوط الخلايا المتنوعة. علاوة على ذلك ، فهي تقنية قيمة تعزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 16،17،18. تظهر النتائج التجريبية أن خلايا SP تظهر ورما واضحا وتعرض مستويات تعبير مرتفعة للجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية19,20. أظهرت دراستنا السابقة21 أيضا أن التحليل النسخي لخلايا SP المعزولة في المايلوما المتعددة يكشف عن إثراء مسارات الإشارات المرتبطة بالخلايا الجذعية ، مثل مسار القنفذ. وفي الوقت نفسه ، أجرينا تحليلات إثراء المسار على الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في خلايا SP لسرطان الدم النقوي الحاد22. تم إثراء الجينات المعدلة في المسارات المتعلقة بالخلايا الجذعية (Wnt / β-catenin ، TGF-β ، Hedgehog ، Notch). وجدنا أن خلايا 1 × 105 SP يمكن أن تشكل أوراما في الفئران الخالية من BALB / c22 ، في حين أن الخلايا غير SP لا تستطيع ذلك ، مما يشير إلى أن خلايا SP لها خصائص الخلايا الجذعية لسرطان الدم. فعالية طريقة Hoechst SP في تحديد CSCs واضحة.

تم تنقيح بروتوكول Hoechst SP وتعزيزه من خلال تقدم البحث. يستلزم البروتوكول رقابة صارمة على تركيز الصبغة وكثافة الخلية ودرجة حرارة الحضانة ومدتها وتكوين المخزن المؤقت وقيمة الأس الهيدروجيني. خضعت عينات الخلايا المحضرة وفقا لهذا البروتوكول لتحليل التدفق الخلوي. نظرا لإثارة صبغة Hoechst بليزر الأشعة فوق البنفسجية عند 355 نانومتر والكشف عن انبعاث التألق باستخدام كل من مرشح 690/50 نانومتر (Hoechst Red) ومرشح 450/50 نانومتر (Hoechst Blue) ، يلزم وجود ليزر 350 نانومتر ل FCM. ومع ذلك ، لا يتم تجهيز ليزر 350 نانومتر بشكل شائع في معظم أجهزة FCM بسبب تكلفتها العالية. ومن ثم ، حاولنا إيجاد نهج بديل لإثارة الصبغة للكشف الفعال عن خلايا SP عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، تم تقييم قدرة الليزر 375 نانومتر و 405 نانومتر في الكشف عن خلايا SP ومقارنتها بقدرة الليزر 355 نانومتر. تظهر النتائج التي توصلنا إليها تشابها ملحوظا بين خلايا SP المكتشفة بواسطة ليزر 355 نانومتر و 375 نانومتر و 405 نانومتر. تشير هذه النتائج إلى أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يكون بمثابة بدائل مجدية لليزر 355 نانومتر للكشف عن خلايا SP. إن تضمين مصادر ضوء إثارة إضافية ل Hoechst 33342 يسهل استخدام المزيد من نماذج قياس التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

استخدمت التجارب في هذه الدراسة ما مجموعه 10 فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا. أجريت العمليات التجريبية وفقا لبروتوكول تمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سيتشوان (# 201609309). يتم سرد المواد التجريبية ومعلمات قياس التدفق الخلوي المستخدمة في هذه المقالة في جدول المواد.

1. عزل وجمع خلايا نخاع عظم الفأر

  1. القتل الرحيم للفئران بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية. للحث على فقدان الوعي في الفأر ، يتم تطبيق التخدير بالاستنشاق بدءا من 2٪ إيزوفلوران ، تليها زيادة تدريجية في الجرعة إلى 5٪ إيزوفلوران حتى توقف التنفس.
  2. تشريح الفئران في الجناح الجراحي أو خزانة الدخان. تنظيف وتعقيم الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
  3. قطع الجلد والعضلات في الساق بمقص حاد تماما وتشريح عظم الفخذ.
  4. سحق عظم الفخذ برفق بقضيب طحن في هاون واطرد خلايا نخاع العظم بوسط DMEM حتى يتحول العظم إلى اللون الأبيض.
  5. قم بتصفية خلايا نخاع العظم التي تم الحصول عليها باستخدام مرشح 100 ميكرومتر في أنابيب سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. تخلص من الخلايا الحمراء الطافية وتحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية مع 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اغسل مرة أخرى باستخدام وسط DMEM.
  7. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول الحضانة (وسط DMEM + 5٪ FBS) ، وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي واضبط تركيز الخلية على 1.0 × 106 خلايا / مل مع محلول الحضانة.

2. تلطيخ الخلوية

  1. ملحق 2 مل من معلق خلايا نخاع العظم من كل فأر مع 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342. إلى 1 مل أخرى من القسمة ، أضف 100 ميكرومتر فيراباميل كعنصر تحكم سلبي.
  2. احتضن في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع تحريك لطيف كل 30 دقيقة.
  3. بعد الحضانة ، قم بتبريد الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في محلول تشغيل بارد (HBSS + 2٪ FBS). أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في 500 ميكرولتر من محلول التشغيل لكل عينة. قبل تحليل FCM ، استكمل الخلايا ب 2 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (PI) وضعها على الجليد لمدة 5 دقائق تقريبا.

3. قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: للحصول على ملخص لمختلف الأنظمة والتكوينات المستخدمة، يرجى الاطلاع على الجدول 1.

  1. معايرة قيم معامل الاختلاف (CV) للقنوات المطلوبة باستخدام الفلوروسفير اليومي لمراقبة الجودة (QC) في FCMs وإجراء اختبار العينات بعد الانتهاء بنجاح من مراقبة الجودة.
    1. حدد اختصار سطح المكتب للبرنامج وقم بتشغيل البرنامج.
    2. حدد بدء مراقبة الجودة/التوحيد القياسي في قائمة مراقبة الجودة/التوحيد القياسي للوصول إلى تجربة مراقبة الجودة.
    3. أدخل أنبوب عينة الفلوروسفير QC في حامل الأنبوب.
    4. حدد البدء لتحميل العينة والبدء في تشغيل إجراء مراقبة الجودة. FCMs جاهزة للاستخدام بعد مرور مراقبة الجودة.
  2. قم بإثارة صبغة Hoechst 33342 لنفس العينات باستخدام ليزر 355 نانومتر و 375 نانومتر و 405 نانومتر ، على التوالي ، للكشف عن أحمر Hoechst في قناة 690/50 نانومتر و Hoechst blue في قناة 450/50 نانومتر.
    1. قم بإنشاء تجربة جديدة عن طريق تحديد تجربة جديدة في القائمة ملف، وحدد مسار الملف، واحفظ التجربة.
    2. حدد تعيين القناة في قائمة الإعدادات. حدد خانة الاختيار إشارة القناة (Y585، V450، V660، NUV450، NUV660، UV450، UV660)، ثم أضف اسم الكاشف في عمود التسمية (Y585: PI; V450: هويشت بلو-405 نانومتر؛ V660: هويشت الأحمر 405 نانومتر ؛ NUV450: هويشت بلو-375 نانومتر ؛ NUV660: هويشت بلو-375 نانومتر ؛ UV450: هويشت بلو -355 نانومتر ؛ UV660: هويشت بلو-355 نانومتر).
    3. انقر فوق أيقونات مخططات الألوان الزائفة في منطقة الرسم لإنشاء مؤامرات. حدد اسم محور لتغيير القناة التي يتم عرضها.
    4. انقر فوق إضافة أنبوب في شاشة أنبوب الاختبار لإنشاء أنابيب عينة جديدة وتغيير أسمائها.
    5. حدد تشغيل لتحميل العينة وعرض المؤامرات وإنشاء البوابات. اضبط إعدادات الكسب والعتبة. حدد سجل لحفظ البيانات.
  3. تصميم منطق إعداد البوابة.
    1. بالنسبة للمخطط الأول ، انقر فوق المحور X لتحديد FSC-W وانقر فوق المحور Y لتحديد FSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة A لوضع دائرة حول الخلية الفردية واستبعاد الخلايا الملتصقة (الشكل 1A).
    2. بالنسبة للمخطط الثاني ، انقر فوق المحور X لتحديد FSC-A وانقر فوق المحور Y لتحديد SSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة B لفصل الخلايا غير المجزأة واستبعاد الحطام الخلوي (الشكل 1B).
    3. بالنسبة للمخطط الثالث ، انقر فوق المحور X لتحديد PI-A وانقر فوق المحور Y لتحديد SSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة D. حدد الخلايا الحية التي تظهر PI سالبة (الشكل 1C) وارسم البوابة C للحصول على الخلايا الحية.
    4. بالنسبة للمخطط الرابع ثنائي الأبعاد ، انقر فوق المحور X لتحديد Hoechst Red وانقر فوق المحور Y لتحديد Hoechst Blue. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المؤامرة وحدد خاصية من القائمة المنسدلة. حدد التنسيق الخطي fأو كلا المحور X والمحور Y. حدد بوابة المضلع لرسم بوابة SP للحصول على خلايا SP (الشكل 1D).
  4. لتقييم أهلية العينة ، استخدم 355 نانومتر من مقياس التدفق الخلويالمحدد 23 لاكتشاف خلية SP.
  5. استخدم ليزر 355 نانومتر (طاقة الليزر: 20 ميجاوات) و 405 نانومتر (طاقة الليزر: 80 ميجاوات) في وقت واحد لاكتشاف كل من خلايا التحكم (مع إضافة فيراباميل) والخلايا التجريبية.
  6. الحصول على إشارات مضان عند قنوات 690/50 نانومتر و 450/50 نانومتر المقابلة لليزرتين. راقب التحفيز الفعال لصبغة Hoechst 33342 بواسطة ليزر 355 نانومتر و 405 نانومتر مع خلايا SP واضحة (الشكل 2B-C).
  7. بالنسبة لنفس العينات ، استخدم ليزر 375 نانومتر (طاقة الليزر: 60 ميجاوات) و 405 نانومتر (طاقة الليزر: 80 ميجاوات) لاكتشاف الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الشكل 2 ، عولجت المجموعة الضابطة بالفيراباميل ، الذي يمنع ناقلات ABC في الخلايا الجذعية لمنع التخلص من Hoechst 33342. وبالتالي ، فإن الخلايا الجذعية في المجموعة غير فيراباميل تطرد Hoechst 33342 وتشكل مجموعة خلايا سالبة تعرف باسم خلايا SP. أثار ليزر 355 نانومتر صبغة Hoechst 33342 بشكل فعال ، مم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

استخدمنا البروتوكول الموصوف لإجراء ثلاث تجارب ، كل تجربة شملت 3-4 فئران ، مما أدى إلى ما مجموعه 10 فئران. تراوحت نسبة خلايا SP من 0.05٪ إلى 0.76٪. من المهم أن نلاحظ أنه لوحظت اختلافات فردية بين الفئران. استخدمنا أربعة مقاييس للتدفق الخلوي لتحليل عينات Hoechst. لوحظ أن إثارة صبغة Hoechst بواسطة ليزر 20 mW 355 nm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى J.H. من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81800207). إن مساعدة شركة Beckman Coulter، Inc. في تقديم الدعم لقياس التدفق الخلوي ومعايرة المعلمات موضع تقدير كبير. نشكر جياو تشن من مختبر الدولة الرئيسي لأمراض الفم ، مستشفى غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان ، ويو تشي من مركز أبحاث الطب التجديدي ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، لمساعدتهم في الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Automatic cell counterCountstar1M1200
Cell Filter(100 µm)BIOFILCSS-013-100
Daily quality control fluorospheresBeckman CoulterB5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)CORNING10-013-CVRC
Fetal bovine serumCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
Red blood cell lysis bufferBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

References

  1. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  2. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  3. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  4. Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1. Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).
  5. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  6. Terrace, J. D., et al. Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells. Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).
  7. Martin, J., et al. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).
  8. Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity. J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).
  9. Mouthon, M. A., et al. Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'. J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).
  10. Cordon-Cardo, C. Cancer stem cells. Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).
  11. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  12. Yun, E. J., et al. Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).
  13. Lupia, M., Cavallaro, U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity. Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).
  14. Zhao, R., et al. AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).
  15. Liu, S., et al. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).
  16. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  17. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  18. Haraguchi, N., et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).
  19. Zhou, J., et al. Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).
  20. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).
  21. Wang, F., et al. ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population. Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).
  22. Wang, F., et al. Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway. Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).
  23. Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. Analysis of side population in solid tumor cell lines. J Vis Exp. (168), e60658(2021).
  24. Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform. Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved