تحريض إصابة نقص تروية الشبكية وإعادة تروية العين في نموذج عين الفأر

Summary

يصمم هذا البروتوكول إصابة نقص تروية الشبكية وإعادة تروية الشبكية في عين الفأر عن طريق إحداث نقص تروية الشبكية عن طريق قنية الغرفة الأمامية ورفع ضغط العين ، متبوعا بتطبيع ضغط العين لبدء إعادة التروية.

Abstract

من المعروف أن إصابات التروية وإعادة تروية الدم تسبب مجموعة من أمراض الشبكية ، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري ، والزرق ، وانسداد الأوعية الدموية في الشبكية ، وغيرها من حالات انسداد الأوعية. تقدم هذه المخطوطة طريقة لإحداث إصابة نقص التروية وإعادة التروية في نموذج الفأر. استخدمت الطريقة قنية الغرفة الأمامية المتصلة بخزان ملحي ، مما يولد ضغطا هيدروستاتيكي لرفع ضغط العين إلى 90-100 مم زئبق. تسببت هذه الطريقة بشكل فعال في انقباض الشعيرات الدموية للحث على نقص تروية الشبكية. في نهاية الفترة الإقفارية (60 دقيقة) ، تم تطبيع ضغط العين (≤20 مم زئبق) قبل إزالة القنية من الغرفة الأمامية لبدء إعادة التروية. بعد أيام من إجراء نقص التروية / إعادة التروية ، تم جمع العيون وتقطيعها بحثا عن تلطيخ نسيجي. تم تسجيل علم الأنسجة المرضي لأقسام الشبكية من خلال تقييم ثمانية معايير لإصابة الشبكية: الطيات ، والنزيف ، والتشوه ، وفقدان الخلايا في الخلية العقدية ، والطبقات النووية الداخلية ، والنووية الخارجية ، والطبقات المستقبلة للضوء ، وتلف الخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية. قدمت هذه الطريقة نموذجا قابلا للتكرار لدراسة آليات وأمراض إقفار الشبكية / إصابة إعادة التروية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يسهل اكتشاف الأهداف العلاجية المحتملة لعلاج إصابات نقص تروية الشبكية / إعادة التروية ، وتعزيز دراسة أمراض الشبكية وتحسين نتائج المرضى.

Introduction

تظهر إصابات التروية / إعادة التروية في أمراض الشبكية المختلفة ، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري ، والزرق ، وانسداد الأوعية الدموية في الشبكية ، وحالات انسداد الأوعية الدموية ذات الصلة. نظرا لارتفاع الطلب على الأكسجين في شبكية العين ، فهي معرضة بشكل خاص لإصابة نقص التروية / إعادة التروية ، وهي ظاهرة متورطة في التسبب في أمراض مثل اعتلال الشبكية السكري. ينتج عن هذا النوع من الإصابة زوال الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) ، والتنكس المورفولوجي لشبكية العين ، وضعف وظيفة الشبكية ، وضعف البصر في نهاية^{المطاف 1}. نمذجة نقص التروية / إعادة التروية مناسبة للدراسات حول الآليات والاستجابات العلاجية في أمراض الشبكية المختلفة المتعلقة بإصابات نقص التروية / إعادة الضهار.

ركزنا على تحسين نموذج لإصابة نقص التروية / إعادة التروية في عين الفأر. تم نشر نموذج قنية الغرفة الأمامية لإصابة نقص تروية الشبكية الناجم عن الضغط لأول مرة بواسطة Büchi et al. في عام 1991². نجحوا في زيادة ضغط العين إلى 110 مم زئبق لفترة مضبوطة. ووجدوا أن إصابة الشبكية الناتجة كانت متوافقة مع النتائج المشابهة لانسداد الأوعية الدموية في الشبكية والمشيمية. نظرا لمنهجيته البسيطة نسبيا وتنفيذه الفعال من حيث التكلفة ، فقد أصبح نموذجا وظيفيا لدراسة إصابة إقفار الشبكية. أضفنا الخطوة الإضافية المتمثلة في خفض مصدر التسريب إلى مستوى الماوس قبل سحب الإبرة. منع هذا تكوين فرق ضغط مرتفع محتمل داخل العين عند إزالة الإبرة ، مما تسبب في تلف العين لا علاقة له بنقص التروية / إعادة التروية.

كان الهدف هو إنشاء نموذج خاضع للرقابة وقابل للتكرار للبحث في آليات وأمراض إقفار الشبكية / إصابة إعادة التروية في نموذج الفأر مع تقليل الضرر الإجرائي للعين. يوفر هذا النموذج طريقة لتحديد العلاجات المحتملة وتعزيز فهمنا لأمراض الشبكية المرتبطة بانسداد الأوعية الدموية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة بوسطن وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر ويتوافق مع بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية.

1. التجارب

1. منزل الفئران C57BL / 6J في ظل الظروف القياسية.

2. تحضير الحل المطلوب وخط التسريب

1. في حقنة سعة 50 مل ، املأ بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم بسعر واحد لكل فأر. ضع المحقنة على ارتفاع 120 سم فوق مستوى سطح المقعد.
2. قم بتوصيل المحقنة المملوءة بخط التسريب ومحبس بإبرة 30 جم متصلة بنهاية الخط. اغسل جميع فقاعات الهواء من الخط.

3. إعداد مساحة العمل

1. قم بإعداد مجهر جراحي / تشريح تحت الزجاجة المالحة.
2. قم بإنشاء سرير لتثبيت الماوس أثناء الإجراء عن طريق قطع منخفض بحوالي 6 سم × 3 سم في إسفنجة ووضعه بإحكام في بئر من الستايروفوم أو حاوية مسطحة أخرى.

4. تخدير الفأر

1. قم بتخدير الفأر بمزيج قياسي من الكيتامين والزيلازين على مستوى لتحقيق التخدير العميق.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم حقن خليط من الكيتامين 100 مجم / كجم والزيلازين 10 مجم / كجم داخل الصفاق لتحقيق عمق تخدير كاف.
2. حقق تخديرا مناسبا عندما لا يكون هناك سحب مخلب استجابة لقرصة إصبع القدم ولا رد فعل وميض عند لمس القرنية برفق. قم بإجراء تخدير إضافي إذا ظهرت على الفأر أي علامات للألم، مثل فرط التنفس أو حركة الأطراف، أثناء التخدير.

5. توسيع القزحية

1. قم بتوسيع قزحية العين المراد تغليفها بقطرة واحدة من 1٪ تروبيكاميد. اترك 5 دقائق للتوسيع. ضع مرهما للعيون مثل الباسيتراسين على العين الذي لن يتم نفره.

6. قنية الغرفة الأمامية

1. ضع الفأر المخدر بإحكام في السرير الإسفنجي تحت المجهر. ضعي المحلول الملحي على العينين لشطف أي حطام أو فراء من سطح العين.
2. استخدم زوجا من الملقط غير المسنن واقترح إحدى العينين برفق.
   ملاحظة: ستستخدم التجربة العينين اليسرى أو اليمنى للماوس ، ولكن ليس كلاهما على نفس الماوس.
3. مع إغلاق خط التسريب ، قم بتقطيع الغرفة الأمامية بالإبرة على بعد حوالي 2 مم من ليفي الطرف. تأكد من أن الإبرة تخترق القرنية بشكل عمودي على سطح القرنية المحيطي المنحني ، ثم يتم تسويتها قليلا بالتوازي مع مستوى القزحية. يمكن التلاعب بالقرنية لدفع الإبرة والحفاظ على التحكم في العين. تجنب ضرب القزحية أو العدسة وتكبير جرح القرنية ، مما قد يؤدي إلى التسرب. تم وصف التفاصيل بمزيد من التفصيل بواسطة Buchi et ^al.2.

7. المرحلة الإقفارية

1. أدر المحبس لتشغيل خط التسريب. تحقق من عدم وجود تسرب عبر جرح القرنية. تأكد من وجود انتفاخ تدريجي للقرنية مع زيادة ضغط العين.
   ملاحظة: إذا لم يتم إغلاق التسرب الكبير مع انفصال القرنية ، فلن يتم الحفاظ على الضغط الكافي ، ويجب أن يكون الإجراء على ماوس مختلف.
2. تأكد من ارتفاع ضغط العين إلى 90-100 مم زئبق باستخدام مقياس توتر العين. قم بتأمين خط التسريب بشريط لاصق ، مع التأكد بعناية من عدم تغيير وضع الإبرة والبدء في التسرب.
3. ضع مرهم للعيون مثل الباسيتراسين على العين المنفوخة لمنع الجفاف. ضع الماوس بعيدا عن المجهر وتحت مصباح التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية ومراقبتها لمدة 60 دقيقة القادمة.
4. أعد قياس ضغط العين قبل 30 دقيقة من انتهاء الإجراء للتأكد من أن ضغط العين يتراوح بين 90-100 مم زئبق.

8. مرحلة إعادة التروية

1. بعد 60 دقيقة ، أعد الماوس إلى المجهر. قم بخفض زجاجة المحلول الملحي إلى مستوى الماوس ، مما يؤدي إلى تطبيع ضغط العين.
2. قم بقياس ضغط العين باستخدام قياس التوتر للتأكد من أنه قريب من المعدل الطبيعي ، 20 مم زئبق. بمجرد تطبيع ضغط العين ، قم بإزالة الإبرة بعناية ، وتجنب تلف العدسة أو القزحية.

9. رعاية ما بعد الجراحة

1. قم بتغطية عيون الفأر بأي مرهم مضاد للبكتيريا للعيون مثل مرهم العيون البيطري للعصيات.
2. راقب الماوس لمدة 1-2 ساعة على سطح ساخن حتى يتعافى تماما من التخدير. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الفئران إلى الأقفاص والسكن بمجرد التعافي التام.

10. استئصال العين³

1. قم بتخدير الفأر أولا بمزيج من الكيتامين 100 مجم / كجم والزيلازين 10 مجم / كجم المحقون داخل الصفاق ثم القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
2. ضع الماوس القتل الرحيم على سطح مستو وجاف وسلس. اشطف العين ببضع قطرات من المحلول الملحي.
3. ضع ضغطا برفق على الكانثوس الجانبي بالملقط حتى يتم إزاحة مقلة العين من التجويف ويمكن الوصول إلى العصب البصري. باستخدام مقص Westcott ، قم بقص الهوامش المدارية لقطع العضلات خارج العين.
4. ضع مقص Westcott على الجانب الخلفي من محجر العين واقطع العصب البصري.

11. إصلاح العينة⁴

1. ضع العين المنزوعة النواة في 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PBS في قارورة محكمة الغلق. بعد 3 أيام ، قم بإزالة العين ، وضعها في قارورة من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ، واحفظها طوال الليل.
2. انزع العينين وضعهما في قارورة من محلول الإيثانول بنسبة 95٪. ثم ضع القارورة في مكنسة كهربائية محكمة الغلق لمدة 15 دقيقة ، ثم أخرجها من المكنسة الكهربائية ، واتركها في هواء الغرفة لمدة 45 دقيقة.
3. كرر عملية التفريغ ، ووضع العين بالتتابع في المحاليل التالية: 100٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، 100٪ محلول زيلين ، و 100٪ محلول زيلين.
4. أزيلي العين وضعيها في قارورة نظيفة وفارغة. املأ القارورة بالبارافين المصفى 60 درجة مئوية. ضع القارورة في فرن مفرغ 60 درجة مئوية محكم الغلق لمدة 30 دقيقة ثم 30 دقيقة في فرن 60 درجة مئوية بدون فراغ.
5. قم بإزالة العين ، وضعها في قارورة نظيفة وفارغة ، واملأها بالبارافين السائل 60 درجة مئوية. قم بتخزين القارورة في درجة حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل.

12. تضمين العينة

1. انقل العين إلى قالب تضمين معدني واملأ القالب بالبارافين المصفى على لوح تسخين 60 درجة مئوية ، وتوجيه العين في الاتجاه المطلوب لعمل أقسام من خلال القرص البصري. اترك القالب يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم قم بتخزينه في 4 درجات مئوية.

13. تقسيم العينة⁵

1. انقل العينات المضمنة إلى الميكروتوم. قم بقص الكتلة ببطء حتى يتم الوصول إلى العين وتشمل الأقسام القرص البصري.
2. قطع الأقسام على شكل شرائط بسمك 5 ميكرومتر وتعويمها في حمام مائي. ارفع شريط البارافين بعناية باستخدام الملقط ، ضع شرائط من ثلاثة أقسام على شريحة ، واتركها تجف طوال الليل.
3. كرر هذه العملية حتى يكون هناك 8 شرائح على الأقل لكل عين مع أقسام متمركزة على القرص البصري.

14. تلطيخ الأقسام⁵

1. سخني الشرائح في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإذابة البارافين. اغمر الشرائح في RT xylene ثلاث مرات ، لمدة 5 دقائق لكل منها.
2. اغمر الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ ثلاث مرات ، لمدة 3 دقائق لكل منها. اشطف الأقسام بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
3. احتضان الأقسام في صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 45 ثانية. اشطف الأقسام بماء الصنبور لمدة 2 دقيقة.
4. احتضان الأقسام في كاشف Bluing لمدة 1 دقيقة. اشطف الأقسام بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
5. احتضان الأقسام في اليوزين لمدة 15 ثانية.
6. اشطف الأقسام بنسبة 95٪ و 100٪ إيثانول مرتين لمدة 1 دقيقة لكل منهما. اشطف الأقسام في الزيلين 100٪ أربع مرات ، لمدة 1 دقيقة لكل منها. ثم قم بتركيب الشرائح بوسائط التركيب.

15. التحليل النسيجي⁶

1. قم بتحليل كل قسم من أقسام الشبكية تحت المجهر وسجل عدد طيات الشبكية ، والنسبة المئوية لفقدان الخلايا في طبقات الشبكية المختلفة (طبقة الخلية العقدية ، والطبقة النووية الداخلية ، والطبقة النووية الخارجية) ، ووجود نزيف زجاجي أو تحت الشبكية ، ومدى تلف ظهارة صبغة الشبكية. راجع الجدول 1 للحصول على تفاصيل حول معايير التسجيل.

النتائج

لتقييم أمراض الشبكية بعد نقص التروية / إعادة التروية ، تم جمع العيون من مجموعة واحدة من الفئران بعد يومين من العملية ومن مجموعة أخرى من الفئران بعد 7 أيام من العملية. تم تثبيت العيون المنزوعة النواة في 4٪ بارافورمالدهيد ، مدمجة في البارافين ، وتقطيعها إلى أقسام 5 ميكرومتر. ...

Discussion

يوفر نموذج نقص التروية / إعادة التروية طريقة قابلة للتكرار لدراسة آليات وأمراض إقفار الشبكية / إصابة إعادة التروية. هذا النموذج مفيد في دراسة أمراض إقفار الشبكية / إصابة إعادة التروية ، ولتحديد الأهداف العلاجية. قد تشكل العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول تحديات وتت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401