A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول استئصال الخلايا العصبية الفردية بالليزر في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة. تمكن هذه الطريقة من دراسة تأثير تقليل المنافسة بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي النامي.

Abstract

يصف البروتوكول الاجتثاث أحادي الخلية العصبية بنظام ليزر 2 فوتون في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ليرقات ذبابة الفاكهة الميلانية السليمة. باستخدام هذه الطريقة غير الغازية ، يمكن التلاعب بالجهاز العصبي النامي بطريقة خاصة بالخلية. يمكن استخدام تعطيل تطور الخلايا العصبية الفردية في الشبكة لدراسة كيف يمكن للجهاز العصبي تعويض فقدان المدخلات المشبكية. تم استئصال الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد في نظام الألياف العملاقة لذبابة الفاكهة ، مع التركيز على اثنين من الخلايا العصبية: الألياف العملاقة قبل المشبكية (GF) والخلايا العصبية الحركية tergotrochanteral بعد المشبكي (TTMn). يتشابك GF مع TTMn المماثل ، وهو أمر بالغ الأهمية لاستجابة الهروب. الاجتثاث واحد من GFs في الدماغ 3الثالثة instar ، مباشرة بعد GF يبدأ النمو المحوري ، يزيل الخلية بشكل دائم أثناء تطوير الجهاز العصبي المركزي. يتفاعل GF المتبقي مع الجار الغائب ويشكل طرفا متشابك خارج الرحم إلى TTMn المقابل. هذا الطرف غير النمطي المتماثل ثنائيا يعصب كلا من TTMns ، كما يتضح من اقتران الصبغة ، ويدفع كلا الخلايا العصبية الحركية ، كما يتضح من المقايسات الفيزيولوجية الكهربية. باختصار ، يوضح استئصال خلية عصبية واحدة منافسة متشابكة بين زوج ثنائي من الخلايا العصبية التي يمكن أن تعوض عن فقدان خلية عصبية واحدة واستعادة الاستجابات الطبيعية لدائرة الهروب.

Introduction

الاستئصال بالليزر هو أداة مفضلة لتشريح الدوائر العصبية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. تم تطويره في أنظمة وراثية نموذجية مثل الديدان والذباب ، وقد تم تطبيقه في جميع أنحاء المملكة الحيوانية لدراسة بنية ووظيفة وتطور الجهاز العصبي1،2،3. هنا ، تم استخدام استئصال الخلايا العصبية المفردة للتحقيق في كيفية تفاعل الخلايا العصبية أثناء تجميع الدائرة في ذبابة الفاكهة. نظام الهروب من الذبابة هو دائرة مفضلة للتحليل لأنه يحتوي على أكبر الخلايا العصبية وأكبر نقاط الاشتباك العصبي في الذبابة البالغة ، وقد تم تمييز الدائرة بشكل جيد في العقود الماضية4. الدور ....

Protocol

كانت جميع المستخدمة في البروتوكول من نوع ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر. لا توجد قضايا أخلاقية تحيط باستخدام هذا النوع. لم يكن التخليص الأخلاقي ضروريا للقيام بهذا العمل. يتم سرد تفاصيل أنواع ذبابة الفاكهة والكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تربية ذبابة الفاكهة واختيار المرحلة اليرقية الصحيحة

  1. اختر خط برنامج تشغيل Gal4 الذي يقود التعبير في الخلايا المراد اجتثاثها وأعد تجميعه مع أو عبره إلى خط مراسل UAS-GFP. رفع الذباب على طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لاستئصال الألياف العملاقة (GF) ، تمت إعادة دمج R91H05-Gal4 أو A307-Gal4 مع U....

النتائج

يمكن استخدام هذه الطريقة للتلاعب بتطوير شبكات عصبية محددة في الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة. كان سؤال البحث الأساسي هنا هو تكوين اتصالات متشابكة. مكنت إزالة GF قبل المشبكي أو TTMn بعد المشبكي من التحقيق في تكوين المشابك التفاعلي في هذا المشبك المركزي والآليات الجزيئية الحاسمة لوظيفة الم?.......

Discussion

أثبت الاجتثاث الخلوي باستخدام مجهر 2 فوتون أنه طريقة ناجحة للغاية لمعالجة تطور الدائرة العصبية في ذبابة الفاكهة. نظرا لأن هذه الطريقة غير جراحية ، فإنها تسبب الحد الأدنى من الضرر للحيوان. تدعم البيانات فائدة هذا التلاعب الخاص بالخلية للدوائر المعروفة.

كان من الأهمية ب?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم إجراء تجارب على مجهر 2 فوتون في معهد FAU Stiles-Nicholson Brain Imaging Core المتقدم للخلايا. نود أن نشكر مبادرة علوم الحياة كوكب المشتري على الدعم المالي.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbitFisher ScientificA111221:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiveNikonMRD77220water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
Drosophila salinerecipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)LabExpress7001-NV
Methyl salicylateFisher ScientificO3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mLEppendorf22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Neurobiotin TracerVector LaboratoriesSP-1120
Nikon A1R multi-photon microscopeNikonon an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced ResearchNikonAcquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Tablets
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost microscope glass slideFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000detergent solution
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Stock Center32185

References

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. A....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved