استخدام مقايسة التحول الحراري لفحص ارتباط الركيزة بالسيلينوبروتين O

Summary

هنا ، نقدم مقايسة التحول الحراري ، وهي تقنية عالية الإنتاجية قائمة على التألق تستخدم للتحقيق في ارتباط الجزيئات الصغيرة بالبروتينات ذات الأهمية.

Abstract

يشكل تحديد الأهمية البيولوجية للبروتينات ذات الوظائف غير المعروفة عقبة كبيرة في فهم العمليات الخلوية. على الرغم من أن التنبؤات المعلوماتية الحيوية والهيكلية قد ساهمت في دراسة البروتينات غير المعروفة ، إلا أن عمليات التحقق من الصحة التجريبية في المختبر غالبا ما تعوقها الظروف المثلى والعوامل المساعدة اللازمة للنشاط الكيميائي الحيوي. ارتباط العامل المساعد ليس ضروريا فقط لنشاط بعض الإنزيمات ولكنه قد يعزز أيضا الاستقرار الحراري للبروتين. يكمن أحد التطبيقات العملية لهذه الظاهرة في الاستفادة من التغير في الاستقرار الحراري ، كما تم قياسه من خلال التغيرات في درجة حرارة انصهار البروتين ، لاستكشاف ارتباط الليجند.

يمكن استخدام مقايسة التحول الحراري (TSA) لتحليل ارتباط الروابط المختلفة بالبروتين محل الاهتمام أو إيجاد حالة استقرار لإجراء تجارب مثل علم البلورات بالأشعة السينية. سنصف هنا بروتوكولا ل TSA باستخدام السودوكيناز ، Selenoprotein O (SelO) ، للحصول على طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لاختبار ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات. على عكس الكينازات المتعارف عليها ، يربط SelO ATP في اتجاه مقلوب لتحفيز نقل AMP إلى سلاسل الهيدروكسيل الجانبية للبروتينات في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم البروتين AMPylation. من خلال الاستفادة من التحول في درجات حرارة الانصهار ، نقدم رؤى مهمة حول التفاعلات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة SelO.

Introduction

لا يزال الكثير من البروتينات البشرية ضعيف التوصيف. يشير "تأثير ضوء الشارع" الذي وصفه دنهام وكوستاتشر وآخرون إلى الظاهرة التي تحظى فيها البروتينات التي تم بحثها على نطاق واسع بمزيد من الاهتمام ، تاركة البروتينات غير المدروسة يتم تجاهلها ^1,2. تشمل العوامل التي تساهم في هذا التأثير الأهمية البيولوجية وأهمية المرض لبعض البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن الأبحاث السابقة التي تقدم المعرفة الأساسية ، فضلا عن توفر أدوات للتحليل الوظيفي ، تحفز البحث في البروتينات المدروسة^{للغاية 1,2}. تهدف مشاريع مثل مبادرة البروتينات غير المدروسة ،....

Protocol

1. الإعداد التجريبي

1. استخدم جهاز تدوير حراري يمكنه اكتشاف التألق ، مثل أداة RT-PCR ، لتنفيذ البروتوكول الموصوف. في حالة استخدام SYPRO Orange ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، استخدم وضع المسح الذي يسمح بالإثارة حوالي 470 نانومتر واكتشاف الانبعاثات حوالي 570 نانومتر. برمجة جهاز التدوير الحراري للاحتفاظ بالعينة عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها زيادة في درجة الحرارة بمقدار 0.5 درجة مئوية / 1 دقيقة حتى 95 درجة مئوية ؛ قياس شدة التألق كل 1 درجة مئوية.
   ملاحظة: نوصي بخطوة اختيارية في نهاية الدورة لإعادة كتلة العينة إلى 20 درجة مئوية (الشكل 1).
2. يحتوي كل تفاعل على أربعة....

النتائج

يتكون Euckaryotic SelO من تسلسل استهداف الميتوكوندريا N-terminal ، ومجال يشبه الكيناز ، وسيلينوسيستين محفوظ للغاية في المحطة C للبروتين²³. يشفر هذا الإنزيم المقيم في الميتوكوندريا مجال السودوكيناز المحفوظ من البكتيريا إلى البشر²³. كشف التحليل الهيكلي لمتما.......

Discussion

يعمل اختبار التحول الحراري (TSA) كطريقة فعالة لفحص تفاعلات البروتين والليجند ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على العوامل المساعدة والمثبطات. في هذا البروتوكول ، استخدمنا TSA لقياس ارتباط السودوكيناز SelO بالنيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. تظهر النتائج التي توصلنا إليه.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA