تطوير وتطبيق فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين

Summary

يصف هذا البروتوكول تصميم وإنشاء وتطبيق الفوسفاتيز الخاضع للتنظيم بالرابامايسين. توفر هذه الطريقة خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية.

Abstract

فوسفاتيز التيروزين هي عائلة مهمة من الإنزيمات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية الحرجة. غالبا ما تكون غير منظمة في الأمراض البشرية ، مما يجعلها أهدافا رئيسية للدراسات البيولوجية. الأدوات التي تمكن من تنظيم نشاط الفوسفاتيز مفيدة في تشريح وظيفتها. تفتقر الأساليب التقليدية ، مثل الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة أو المهيمنة ، أو تقليل التنظيم باستخدام siRNA ، إلى التحكم الزمني. غالبا ما يكون لمثبطات الفوسفاتيز خصوصية ضعيفة ، وتسمح فقط للباحثين بتحديد العمليات التي تتأثر بتثبيط الفوسفاتيز.

لقد طورنا نهجا كيميائيا ، وهو نظام الراباميسين المنظم (RapR) ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للمجال التحفيزي للفوسفاتيز الذي يتيح تحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز. يتكون نظام RapR من مجال iFKBP يتم إدخاله في موقع خيفي في الفوسفاتيز. تعطل الديناميكيات الهيكلية الجوهرية لمجال RapR المجال التحفيزي ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تتوسط إضافة الرابامايسين في تكوين مركب بين iFKBP وبروتين FRB المعبر عنه ، والذي يعمل على استقرار iFKBP واستعادة النشاط إلى المجال التحفيزي للفوسفاتيز.

يوفر هذا النظام خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية. تتيح القدرات الفريدة لهذا النظام تحديد الأحداث العابرة واستجواب مسارات الإشارات الفردية في اتجاه مجرى الفوسفاتيز. يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لتطوير RapR-phosphatase ، وتوصيفه الكيميائي الحيوي ، وتحليل آثاره على الإشارات النهائية وتنظيم الديناميكا مورفو للخلية. كما يوفر وصفا تفصيليا لاستراتيجية هندسة البروتين ، والمقايسات المختبرية التي تحلل نشاط الفوسفاتيز ، وتجارب تصوير الخلايا الحية التي تحدد التغيرات في مورفولوجيا الخلية.

Introduction

فوسفاتيز بروتين التيروزين هي عائلة مهمة من البروتينات المشاركة في عدد كبير من أحداث إشارات الخلية. لقد ثبت أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة وموت الخلايا^{المبرمج 1،2،3}. وبالتالي ، فإن خلل تنظيم بروتين التيروزين فوسفاتيز يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات المنهكة^4،5،6،7. لقد أعاقت دراسة الوظيفة الفسيولوجية لفوسفاتيز التيروزين ودورها في تطور هذه الأمراض تاريخيا بسبب نقص الأدوات اللازمة للت....

Protocol

1. تصميم RapR-phosphatases

1. تخطيط
   ملاحظة: باستخدام RapR-Shp2 كمثال ، يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات المهمة لإنشاء فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين. تم تحسين البروتوكول الموصوف ل Shp2 وقد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إضافية لتناسب خصائص محددة للفوسفاتيز الفردي.
   1. للتأكد من أن النشاط التحفيزي ل Shp2 يتم التحكم فيه بحتة بواسطة الرابامايسين وليس عن طريق الآليات الداخلية ، أدخل طفرة في الفوسفاتيز لإبقائه في شكل نشط أساسي. في حالة Shp2 ، أدخل طفرة D61A.
      ملاحظة: إذا لم يتم إدخال طفرة منشطة ل PTPase معين ، فسيعمل متغير RapR الخاص به كنظام AND مسور ينظمه الإشارات الداخلية والرابامايسين.

النتائج

يوضح الشكل 4 النتائج التي يمكن توقعها من مقايسة نشاط الفوسفاتيز القائم على الباكسيلين. في هذه التجربة ، تمت مقارنة نشاط الفوسفاتيز السلبي النشط والمهيمن من Shp2 بنشاط RapR-Shp2 النشط وغير النشط باستخدام فوسفو باكسيلين كقراءة. تم ترسيب تركيبات Shp2 مناعية وإخضاع?.......

Discussion

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لتطوير وتوصيف وتطبيق الفوسفاتيز التي يتم التحكم فيها كيميائيا. تعتمد أداة RapR-Shp2 على مفتاح منظم بالرابامايسين يتم إدخاله في المجال التحفيزي Shp2. تكمن قوة هذه الأداة في الخصوصية والتحكم الزمني الصارم في نشاط الفوسفاتيز. الأداة قابلة للتطبي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690