طريقة سريعة لحصر النحل والتعامل معه بأمان في الحقل

Summary

نعرض طريقة مجربة للتعامل بأمان مع النحل الذي تم جمعه في الميدان. تسمح هذه الطريقة بالتلاعب السريع وتحديد الهوية وأخذ العينات الجينية وتأكيد تفاعلات النبات والحشرات عبر حبوب اللقاح التي تم جمعها أثناء أخذ العينات. يمكن تكييفه بسهولة ، ويوفر هذا النهج وسيلة فعالة من حيث التكلفة وغير مميتة لدراسة مجموعات الحشرات النادرة.

Abstract

يعد تحسين فهم البيولوجيا الأساسية والبيئة للعديد من الملقحات الحشرية ، وخاصة الأصناف المتخصصة أو النادرة ، أولوية للعديد من الباحثين. على هذا النحو ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى حصر الكائنات الحية التي تم جمعها ميدانيا مؤقتا بطريقة غير ضارة من أجل الحصول على معلومات أو دعم دراسات إضافية. يمثل هذا البروتوكول طريقة ميدانية تم اختبارها بدقة وسريعة وغير مكلفة للتعامل بأمان مع النحل ذي الاهتمام بالحفظ والتي يمكن تخصيصها بسهولة لتلبية احتياجات المشروع المحددة ، بما في ذلك تحديد الكائنات الحية ، وإزالة حبوب اللقاح ، ووضع العلامات ، و / أو جمع عينات الأنسجة غير المميتة للتحليل الجيني. يمكن أن تكون هذه المنهجية بمثابة خيار إضافي في صندوق أدوات الباحث لاستخدامه عند ظهور سيناريوهات معينة. ومن المتوقع أن يمكن تكييف هذه المنهجية لاستخدامها مع أنواع الحشرات الأخرى وكذلك استخدامها من قبل الأفراد من مستويات مختلفة من الخبرة والمهارة. يمكن أن يكون ذا قيمة كبيرة للباحثين الذين يدرسون النحل المتخصص أو يجرون دراسات خاصة بالمضيف. سيكون جمع البيانات الذي أصبح ممكنا بفضل هذا البروتوكول لا يقدر بثمن لمساعدة الباحثين على معالجة فجوات البيانات الحرجة للعديد من أنواع الملقحات ، وهياكل شبكة الملقحات النباتية ، ومبادرات الحفاظ على الملقحات وإدارتها.

Introduction

تدعم مجموعة متزايدة من الأدلة انخفاض أعداد النحل البري والملقحات الأخرى وتغيرات مجتمع الملقحات المصاحبة^1،2،3،4. تهدد الخسائر المستمرة خدمة تلقيح الحشرات الحيوية للحفاظ على التنوع البيولوجي ووظيفة النظام البيئي والإنتاج الزراعي⁵. علاوة على ذلك ، بالنسبة للعديد من النحل البري ، وخاصة الأنواع النادرة ، توجد فجوات معرفية كبيرة يمكن أن تعيق إجراءات الإدارة والحفظ المناسبة^6،7.

للمساعدة في معالجة أوجه القصور هذه في البيانات ، طور الباحثون مجموعة متنوعة من الطرق لدراسة الملقحات الحشرية ، واستخدام الموائل المرتبطة بها ، وتفضيلات الأزهار. في حين أن مصائد عموم ، ومصائد الريشة الزرقاء ، ومصائد الشعور بالضيق ، ومصائد الظهور ، والجمع المباشر عن طريق الشباك اليدوية شائعة الاستخدام ، فإن العديد من هذه الطرق لها عيوب كبيرة^8،9،10،11. يمكن أن تؤدي الطرق الشائعة الاستخدام لتحديد الملقح إلى وفيات الكائنات الحية ، بغض النظر عما إذا كان يجب تحديد العينة في بيئة معملية (على سبيل المثال ، باستخدام المجهر). يمكن أن يكون الوفيات مبررا وضروريا للعديد من دراسات الحشرات. ومع ذلك ، عند العمل مع الحشرات المعرضة للخطر أو النادرة أو غير المدروسة والتي تكون حالتها السكانية محدودة أو غير مؤكدة ، يجب على الباحثين التخفيف من وفيات الكائنات الحية أو الإصابة أو الإجهاد لتقليل احتمالية التأثير سلبا على مجموعات الحشرات هذه. لذلك ، عند العمل مع الأنواع أو الأنواع المعرضة للخطر التي يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال سماتها المميزة الرئيسية ، يجب اتباع مناهج أخذ عينات أقل تدميرا إن أمكن.

تشمل الطرق غير المميتة التي تم اقتراحها لجمع المواد الوراثية من النحل جمع البراز ، و exuviae¹² ، وأطراف الأجنحة¹³. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه الأساليب على النحل الذي يتم جمعه في الحقل قد يكون غير مقبول بسبب الوقت المطلوب و / أو التأثير المحتمل على الأجنحة ، مما يؤثر سلبا على الطيران والسلوكيات الأخرى. لقد ثبت أن الإزالة الجزئية للهوائيات لا تؤثر على بقاء نحل euglossine الذي تم أخذ عينات^{منه 14}. وبالمثل ، فإن أخذ عينات من الجزء النهائي من رسغ منتصف الساق لم يقلل بشكل كبير من بقاء عامل Bombus terrestris ¹⁵. تتضمن طريقة أخذ العينات الإضافية غير المميتة جمع بقايا البروتين عن طريق غمر النحل مؤقتا في محلول عازل ثم إطلاقه لاحقا¹⁶. أظهر تحليل البقاء على قيد الحياة أنه لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين النحل المغسول بالمخزن المؤقت وغير المغسول. هناك قيود على كل تقنية ، والتي يجب مراعاتها عند معالجة أسئلة بحثية محددة وأهداف المشروع العامة.

يعد التحديد التصنيفي الدقيق للكائنات الحية أمرا بالغ الأهمية للبحث الفعال. ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من أصناف الملقحات الحشرية ، فإنها تتوقف بشكل كبير على الأنواع ذات الأهمية ومستوى المعرفة والخبرة للباحث أو المراقب. بينما يمكن تحديد العديد من أنواع النحل في هذا المجال ، فإن وجود أدلة تدعم الملاحظة يمكن أن يكون أمرا بالغ الأهمية. في حين أن معظم دراسات الملقحات عادة ما تجمع الأفراد ويحتفظون بهم كدليل ، يمكن استخدام الصور ومقاطع الفيديو ، بالإضافة إلى تصوير الفيديو ثلاثي الأبعاد باستخدام الواقع الافتراضي كوكيل للتمييز بين أنواع معينة دون التضحية بالأفراد الذين يتم^{ملاحظتهم 17}. قد يتطلب التمايز بين بعض الأنواع اهتماما خاصا وصورا فوتوغرافية لسمات مورفولوجية محددة. في هذه الحالات ، يجب أن تكون الكائنات الحية قادرة على التلاعب بها وحصورها في موضع فريد بحيث يمكن تصوير الشخصيات المميزة المعقدة بشكل موثوق.

يمكن حصر النحل مؤقتا لتحديد الهوية بعدة طرق ، بما في ذلك تبريد العينة و / أو استخدام ثاني أكسيد الكربون لإبطاء النحل^18،19. ومع ذلك ، قد تغير هذه الطرق السلوك ، مما يؤدي إلى أن يكون النحل المعالج أبطأ في استعادة النشاط ، مما قد يؤثر على البحث عن الطعام ، أو لياقة الكائن الحي ، أو يزيد من خطر الافتراس^20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، تزيد هذه التقنيات في النهاية من الوقت الذي يتم فيه حصر الكائنات الحية والتعامل معها. وهذا بدوره يزيد من إجهاد الكائن الحي ووقت المعالجة الميدانية. ولذلك فإن المنهجيات الأكثر أمانا وكفاءة ستكون مرغوبة للغاية.

استخدم عدد من الدراسات حبوب اللقاح التي تم جمعها من النحل أو مصادر أخرى لفهم تفضيلات البحث عن الطعام بشكل أفضل ، وبناء شبكات تفاعل الملقحات النباتية ، وتحديد التلوث البيئي (على سبيل المثال ، بقايا المبيدات) ، وتقييم البيئة الغذائية^{23،24،25،26،27،28،29}. سوف يعتني العديد من النحل بنفسه عند احتجازه في وعاء. لذلك ، تم استخدام طرق غير مميتة لأخذ عينات حبوب اللقاح³⁰ (على سبيل المثال ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة). ومع ذلك ، في الحالات التي لا يتم فيها الاستمالة الذاتية ، فإن استخدام حاوية أكثر لمسا ، مثل الأكياس البلاستيكية القابلة لإعادة الإغلاق المستخدمة في هذا البروتوكول ، يسمح بالضغط اللطيف على أجزاء معينة من الجسم بحيث يتلامس حبوب اللقاح مع الكيس البلاستيكي ، مما يؤدي إلى زيادة احتمالية الحصول على عينة من حبوب اللقاح من استخدام الحاويات الصلبة التقليدية.

هنا ، نقدم بروتوكولا تم اختباره جيدا على ثلاثة أصناف من النحل المعرضة للخطر. على الرغم من أنه يتطلب عمالة مكثفة ، إلا أنه يسمح بجمع بيانات شاملة من الملقحات الحشرية مع تقليل خطر الوفيات على الكائنات الحية الفردية. الهدف العام من استخدام هذه المنهجية هو توفير وسيلة آمنة وفعالة لالتقاط الحشرات وتحديدها وإطلاقها بأمان. ميزة إضافية لهذا البروتوكول هي أنه يتغلب على العديد من قيود جمع الحشرات التقليدية. يوفر طريقة سهلة لتمييز الأفراد ، وجمع المواد الوراثية غير المميتة ، وجمع عينات حبوب اللقاح ، كل ذلك مع تقليل وقت المناولة والضغط على الكائن الحي. في حين أن طرق جمع الحشرات التقليدية لها فوائد عديدة³¹ ، للمساعدة في التغلب على بعض قيودها ، أنشأنا بديلا بحيث يمكن حصر الحشرات للتعرف عليها قبل إطلاقها بسرعة وآمنة. اعتمادا على أهداف المشروع ، يمكن أيضا اتخاذ خطوات إضافية أثناء اقتصار النحلة على جمع البيانات المهمة الأخرى.

Protocol

1. إعداد الجمع الميداني

1. تأكيد أهداف المشروع (على سبيل المثال ، تحديد الكائن الحي ، وأخذ عينات من الأنسجة الوراثية ، وما إلى ذلك).
2. راجع جدول المواد واجمع جميع العناصر ذات الصلة الخاصة بأهداف المشروع.
3. تأكد من شحن جميع المعدات الرقمية (على سبيل المثال ، الهاتف الذكي والكاميرا ونظام تحديد المواقع العالمي المحمول باليد [GPS]) بالكامل وأن البطاريات الاحتياطية مشحونة ومعبأة.

2. التقاط وتأمين الكائن الحي

1. سجل معلمات الموقع ذات الأهمية عند الوصول إلى الميدان ، بما في ذلك التاريخ ووقت البدء وموقع الحقل / الموقع وأي معلومات أخرى ذات صلة (على سبيل المثال ، الظروف الجوية ، ونباتات الغطاء الأرضي السائدة ، والنباتات المزهرة ، وما إلى ذلك) التي قد تكون مطلوبة (الشكل 1).
2. التقط نحلة فردية ذات أهمية باستخدام تقنية المعاوضة المناسبة. استخدم الشباك اليدوية عبر شبكة حشرات هوائية أو شبكة كنس بناء على الأنواع البؤرية.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تقنيات الالتقاط الأخرى ، مثل التجميع عبر أنبوب القارورة / الطرد المركزي ، لالتقاط الحشرات.
3. راقب العينة بصريا من خلال الكيس الشبكي لتحديد ما إذا كانت تشبه التصنيف المثير للاهتمام. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فحرر العينة بأمان واستمر في المسح.
4. إذا بدت العينة وكأنها النوع البؤري ، فقم بتأمين العينة داخل الكيس الشبكي بحيث لا يمكنها الهروب (على سبيل المثال ، عن طريق تداخل الجزء العلوي من الكيس الشبكي فوق الإطار ، أو لف / حصر عنق الكيس الشبكي ، أو إغلاق أي مخارج محتملة).
5. اجمع كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق وافتح كيس العينة.
6. تأكد من أن النحلة محل الاهتمام بالقرب من طرف الكيس الشبكي.
7. بيد واحدة ، أمسك الكيس الشبكي أسفل العينة مباشرة. أمسك الكيس الشبكي بحيث يكون الطرف (حيث تكون الحشرة محصورة) موجها لأعلى وتتدلى فتحة الشبكة (أي الطوق) أدناه.
   ملاحظة: معظم الحشرات ضوئية التغذية ، وعندما تكون محصورة ، تطير / تزحف بشكل عام نحو الضوء.
8. باستخدام اليد الأخرى (أي اليد التي لا تمسك الكيس الشبكي) ، قم بتوجيه كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق في فتحة الشبكة وعبر الكيس الشبكي حتى يصل المرء إلى اليد أسفل العينة مباشرة.
9. حرر قبضة اليد بعناية ، وقم بتقييد العينة بما يكفي لتمكين اليد التي تمسك كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق بالانتقال إلى المنطقة المحصورة مع العينة. ضع في اعتبارك موقع العينة داخل المنطقة المحصورة لتقليل احتمالية التعرض للسع وإلحاق الضرر بالعينة والهروب.
10. قم بمعالجة كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق لفتحه على نطاق واسع بما يكفي للسماح لعينة الحشرة بالدخول. افعل ذلك عن طريق الضغط على جانبي الختم أو لف الكيس بالإبهام والإصبع الأوسط أسفل الختم.
11. ضع فتحة كيس العينة القابلة لإعادة الإغلاق فوق العينة وقم بمناورة الحشرة برفق في الكيس. كما ذكرنا سابقا ، نظرا لأن معظم الحشرات ضوئية التغذية ، قم بتوجيه اليد التي تحتوي على كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق نحو الشمس / السماء ، وبالتالي تسهيل حركة العينة في الكيس.
12. بمجرد دخول العينة ، أغلق كيس العينة القابل لإعادة الغلق بإحكام.
13. قم بإزالة كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق الذي يحتوي على العينة من شبكة الحشرات.
    ملاحظة: نظرا لأن الحشرات يمكن أن ترتفع درجة حرارتها بسرعة ومميتة في أكياس محكمة الغلق ، احتفظ بالعينة بعيدا عن التعرض المباشر لأشعة الشمس ، من الناحية المثالية في مكان مظلل أو حاوية معزولة حتى المعالجة ، والحد من وقت المعالجة.

3. تحديد الكائن الحي

1. افحص العينة عن كثب للتأكد من أنها تصنيف مثير للاهتمام. إذا كان نوعا مختلفا ، فحرره بأمان واستمر في المسح.
   ملاحظة: لتجنب إلحاق الضرر بالعينة ، لا تضغط أبدا على الحشرة أثناء وجودها داخل الكيس. يمكن تثبيت العينات عن طريق الضغط اللطيف على البلاستيك أو عن طريق تمديد محيط الكيس لجعل الكيس مشدودا حول العينة ، وبالتالي الحد من الحركة.
2. إذا كان من الممكن تأكيد هوية الأنواع بسهولة ودقة بصريا ، فخذ قسيمة صورة (الشكل 2). سجل أي معلومات إضافية ضرورية حول العينة (على سبيل المثال ، وقت الالتقاط ، وموقع GPS المحدد ، والنبات الذي تمت زيارته ، والعلامات الفريدة ، ومراقبة الحجم أو اللون ، والسلوك قبل الالتقاط ، وما إلى ذلك).
3. إذا كانت هناك حاجة إلى فحص ميزات مادية معينة لتأكيد الهوية ، فالتقط صورا ماكرو مفصلة تسلط الضوء على تلك الميزات الرئيسية من خلال كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق (الشكل 2).
4. إذا لم يكن من الممكن الحصول على صور ذات جودة كافية لتمييز الميزات من خلال كيس العينة ، فقم بكشف جزء (أجزاء) جسم العينة محل الاهتمام للفحص الدقيق عن طريق قطع أحد طرفي الزاوية غير المختومين لكيس العينة (أي الزوايا التي يتم تثبيتها معا أو غير قابلة لإعادة الإغلاق). على سبيل المثال ، قم بقطع ثقب صغير لكشف الرأس أو البطن أو الساق فقط (الشكل 3A-C). لهذا ، قم بمعالجة العينة بحيث يتحرك جزء الجسم محل الاهتمام أولا نحو فتحة القطع / الزاوية.
   ملاحظة: قد يلزم تغيير حجم وموضع الثقب المقطوع في الكيس واتجاه الحشرة للحصول على الصورة اللازمة.
5. بعد تحديد الهوية ، انتقل إلى الأقسام ذات الصلة للطرق اللاحقة والمطلوبة. انظر القسم 4 للاطلاع على تقنية إزالة جزء الهوائي ، والقسم 5 لتمييز الحشرات ، و / أو القسم 6 للحصول على عينات حبوب اللقاح.

4. الحصول على عينات وراثية غير مميتة من الهوائيات

1. استخدم المقص لقص إحدى الزاويتين غير المختومين قطريا (أي الزوايا الملحومة معا أو غير القابلة لإعادة الإغلاق) لكيس العينة القابل لإعادة الإغلاق. تأكد من أن القطع الذي تم إجراؤه أكبر بالحد الأدنى من عرض رأس النحلة (الشكل 4).
2. قم بمعالجة العينة بحيث تتحرك رأسا على عقب نحو فتحة القطع / الزاوية.
   ملاحظة: يمكن تكييف هذه الخطوة لجمع عينات الأنسجة الأخرى للتحليل الجيني (على سبيل المثال ، الساق الكاملة ، الساق الجزئية). وفقا لذلك ، قد يلزم تغيير حجم وموضع الثقب المقطوع في الكيس واتجاه الحشرة للحصول على العينة اللازمة.
3. بمجرد أن يبرز رأس النحلة من الكيس ، اضغط برفق على البلاستيك المحيط لجعله مشدودا حول الحشرة ، مما يحد من الحركة (الشكل 3 أ).
4. إذا كان الثقب كبيرا جدا ، فقم بلف الكيس على نفسه لتقييد فتحة الفتحة وتأمين العينة. إذا لم تكن متأكدا من حجم الثقب المناسب ، فقم بتنفيذ الخطوتين 4.2 و 4.3 داخل شبكة حشرات أو قفص طيران لضمان عدم هروب العينة بالكامل. استخدم كيسا إضافيا إذا كان قطع الزاوية الأصلي كبيرا جدا.
5. ضع الكيس بحيث يكون رأس الحشرة فوق حاوية التجميع مباشرة (على سبيل المثال ، أنبوب الطرد المركزي الدقيق / قارورة تحتوي على محلول عازل / إيثانول) وأن حاوية العينة الجينية مميزة بشكل مناسب بمعرف العينة الفريد المقابل لجميع بيانات العينة الأخرى (الشكل 3 د).
6. باستخدام مقص تشريح نظيف ومعقم ، قم بقص جزء من جزء هوائي واحد. افحص الحاوية بصريا للتأكد من وجود العينة داخل الحاوية.
   ملاحظة: عند القطع ، من المفيد العمل على ركيزة نظيفة ومعقمة وفاتحة اللون (على سبيل المثال ، Kimwipe). هذا يضمن أنه إذا لم تسقط العينة في حاوية جمع العينة ، فيمكن استعادتها بسهولة باستخدام ملقط مع الحد الأدنى من خطر التلوث.
7. قم بتأمين غطاء حاوية جمع عينات المناديل وقم بتدوير الحاوية بحيث يتم تعليق العينة داخل المحلول (على سبيل المثال ، محلول عازل / إيثانول).
8. ضع حاوية جمع عينات المناديل (مع عينة الهوائي) في حاوية آمنة ، من الناحية المثالية في مكان بارد ومظلل محمي من أشعة الشمس المباشرة و / أو درجات الحرارة القصوى ، مثل مبرد الحقل.
9. حرر العينة بأمان بالقرب من نقطة الالتقاط الأصلية.
   ملاحظة: يمكن أيضا تمييز العينة (انظر القسم 5) قبل إطلاقها للتعرف عليها بسهولة على أنها تم أخذ عينات منها إذا تم إعادة رؤيتها / استعادتها.

5. وضع علامات على الكائن الحي

1. مع وجود العينة في كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق ، قم بقطع ثقب صغير في منتصف كيس العينة.
   ملاحظة: هذا الثقب بالإضافة إلى الفتحة التي تم إنشاؤها في القسم 4. يجب ألا يكون الثقب أكبر من مساحة صدر الحشرة. يمكن أن يختلف موضع المكان الذي يجب قطع الثقب فيه بناء على حجم الحشرة ومنطقة الوسم المطلوبة.
2. قم بالضغط اللطيف على البلاستيك على جانبي العينة ، وقم بمناورة الحشرة بحيث يكون الصدر أسفل الفتحة مباشرة (أي أن الجزء العلوي من الصدر مكشوف من خلال الكيس). استمر في الضغط اللطيف لضمان بقاء العينة في مكانها (الشكل 5 أ).
   ملاحظة: قد تكون مناطق الوسم الأخرى أفضل لبعض الحشرات (الشكل 5 ب). يجد بعض المستخدمين أنه من المفيد جعل الثقب الموجود (من القسم 4) أكبر والاستيلاء على النحلة عن طريق إمساك صدرها عند ظهورها (الشكل 5 ج). قد يزيد هذا النهج من فرصة التعرض للسع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل أجهزة تعليم ملكة نحل العسل لحصر النحل وتمييزه إذا وجد المستخدم ذلك أسهل. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة النقل إلى جهاز مختلف ويمكن أن تلوث عينات حبوب اللقاح.
3. باستخدام قلم تعليم الطلاء (أو أي مادة تعليم أخرى تعتبر مناسبة للتصنيف محل الاهتمام) ، قم بتمييز العينة وفقا للمنهجية المحددة مسبقا الخاصة بالمشروع.
   ملاحظة: ستختلف طرق الوسم بناء على الأهداف وقد تكون بسيطة ، مما يشير إلى أن الفرد قد تم القبض عليه ، أو معقدة ، مما يسمح بتحديد الأفراد (على سبيل المثال ، باستخدام ترميز لوني فريد أو زخرفة) (الشكل 5 ج).
4. أمسك العينة في مكانها حتى تجف العلامة المطبقة بشكل كاف.
5. قم بتصوير الفرد المحدد لتأكيد التلوين الفريد وموضع اللون.
   ملاحظة: يمكن تصوير الأفراد بسهولة وسرعة مباشرة من خلال كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق (الشكل 5 د).
6. حرر العينة بأمان بالقرب من نقطة الالتقاط الأصلية.

6. جمع عينات حبوب اللقاح

1. مع وجود العينة في كيس العينة القابل لإعادة الغلق ، افحصها بعناية بحثا عن أي حبوب لقاح مرئية.
   ملاحظة: نظرا لاختلاف نوع حبوب اللقاح وكميته بشكل كبير ، في بعض الأحيان لا يكون حبوب اللقاح مرئيا على العينة بالعين المجردة. إذا تم الانتهاء من الخطوات السابقة بالفعل ، فمن المحتمل أن تكون بقايا حبوب اللقاح من العينة موجودة بالفعل في الكيس.
2. إذا كانت حبوب اللقاح مرئية على العينة ، فقم بتقييد حركة العينة عن طريق الضغط برفق على البلاستيك على جانبيها.
3. باستخدام إصبع ، افرك البلاستيك برفق أو ادفعه ضد المجموعات أو جزء الجسم المحتوي على حبوب اللقاح لتسهيل إزالة حبوب اللقاح.
4. إذا لم تكن حبوب اللقاح مرئية على العينة ، فقم بزيادة التلامس بين العينة والبلاستيك لمعرفة ما إذا كانت أي بقايا حبوب اللقاح الصغيرة قد تمت إزالتها من التكامل.
5. تأكد بوضوح من وجود حبوب اللقاح في كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق ، إن أمكن (الشكل 4).
6. حرر العينة بأمان بالقرب من نقطة الالتقاط الأصلية.
7. أغلق بإحكام كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق الذي يحتوي على عينة حبوب اللقاح.
   ملاحظة: إذا تم قطع ثقب في كيس العينة القابل لإعادة الغلق ، فيجب وضعه داخل كيس عينة آخر قابل لإعادة الإغلاق لتجنب تلوث حبوب اللقاح أو فقدانها.
8. قم بتسمية كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق بمعرف عينة فريد يتوافق مع الحشرة الفردية والبيانات الأخرى (على سبيل المثال ، معرف أنواع الحشرات ، والتاريخ ، والموقع ، والوقت ، والجنس ، وسجل زيارة الأزهار ، وما إلى ذلك).
9. ضع كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق مع عينة حبوب اللقاح في وعاء آمن ، ويفضل أن يكون ذلك في مكان أكثر برودة ، لحمايتها من أشعة الشمس المباشرة و / أو درجات الحرارة القصوى.
   ملاحظة: إذا كان ذلك مناسبا ، اتبع بروتوكولات خاصة بالمشروع للحفاظ على حبوب اللقاح الميدانية (على سبيل المثال ، التحليل الجيني ، مورفولوجيا حبوب اللقاح).

النتائج

تم استخدام هذه المنهجية لثلاثة أنواع من النحل المعرضة للخطر (Osmia calaminthae و Caupolicana floridana و C. electa) في جنوب شرق الولايات المتحدة. حتى الآن ، تم جمع مئات النحل والدبابير وإطلاقها بأمان. لم يمت أي نحل أثناء استخدام هذه المنهجية. تم التضحية بتلك التي تم تعيينها كعينات قسيمة والاحتفاظ بها كسجل موقع جديد لدى وكالة الإدارة المناسبة بشكل مناسب بعد جمع البيانات. يوضح الجدول 1 السمات المورفولوجية المختلفة التي تم تقييمها بالإضافة إلى البيانات الأخرى القابلة للقياس الكمي التي يمكن جمعها باستخدام هذا البروتوكول^{14،32،33،34،35،36}.

الشكل 1: مثال على ورقة البيانات التي توضح البيانات التي يمكن جمعها أثناء وجودها في الحقل. ستختلف البيانات المحددة التي تم جمعها بناء على أهداف المشروع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور لتكون بمثابة قسائم يعد التقاط الصور لتكون بمثابة قسائم للحدث أمرا ضروريا لأغراض الإبلاغ. تعد صور ميزات التعريف المميزة ضرورية عندما تشترك أنواع متعددة في خصائص متشابهة. يمكن تمييز Anthidium maculifrons الموجود في فلوريدا عن غيره في الجنس بناء على اللون الأصفر على سكيب ورأسه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: وضع الفتحة في كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق. يمكن تغيير موضع الثقب في كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق لعرض أجزاء معينة من الجسم ذات الأهمية للصور الفوتوغرافية أو العينات الجينية. في هذه الصورة المركبة ، يتعرض رأس النحلة (A) و (B) البطن و (C) الساق للصورة. بمجرد أن تكون النحلة محصورة ولا تستطيع التحرك ، غالبا ما تستريح ويمكن وضعها للحصول على صورة ماكروفوتوغرافي. (د) يمكن أيضا أخذ عينة وراثية عندما تكون النحلة في هذه المواقف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: حقيبة جمع مع نحلة تظهر زاوية واحدة مقطوعة قطريا. إذا كنت ترغب في مراقبة رأس النحلة عن كثب ، فإن القطع الموجود في زاوية الكيس سيختلف في الحجم بناء على حجم رأس النحلة. يمكن العثور على حبوب اللقاح وحتى إفرازات الرحيق في الكيس لتحديد حبوب اللقاح في المستقبل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صور لكيس عينة قابل لإعادة الغلق مع النحل. لتجنب التعرض للدغة أثناء وضع علامة على النحلة ، يمكن عمل ثقب في الكيس ، ويمكن وضع الصدر (A) تحت الفتحة. (ب) اعتمادا على حجم النحلة ، يمكن أيضا تمييزها على البطن. (ج) بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تحرير النحلة من فتحة الزاوية وضغطها عند الصدر لوضع العلامات. يمكن أن تزيد هذه التقنية من فرصة الإصابة باللدغة ولكن يبدو أنها تقلل من تلطيخ القلم. يمكن استخدام التلوين / الترقيم الفريد للتمييز بين الأفراد. (د) يمكن تصوير العينات المستعادة في المستقبل بسرعة وسهولة من خلال كيس العينة القابل لإعادة الإغلاق وإطلاقها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تم تقييم السمات المورفولوجية باستخدام هذا البروتوكول. يمكن أيضا التلاعب بالعينات لمراقبة وتوثيق العديد من السمات غير الممثلة في هذا الجدول (على سبيل المثال ، شكل الترجيت / الستيرنيت ، الطول الكلي ، الوزن ، عدد الأسنان ، تعرق الجناح ، المسافة بين العيجومات ، إلخ). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يحدد هذا البروتوكول طريقة ميدانية للتعامل مع النحل النادر وفحصه بأمان مع الهدف النهائي المتمثل في الحصول على معلومات العينة أو القسيمة غير المميتة المرغوبة وإطلاق الأفراد البؤريين بأمان مرة أخرى إلى البرية في نقطة الالتقاط الأصلية. تتمثل فوائد هذا البروتوكول على طرق الجمع الأخرى ، مثل استخدام القوارير ، في أنه يمكن حصر العينة بأمان للسماح بالفحص الدقيق للسمات الرئيسية والتعرف الواثق ، مما يحد من الضرر الذي يلحق بكل من الحشرة والمحقق. على العكس من ذلك ، كما هو الحال مع المنهجيات الأخرى^{18 ، 19} ، لا يتطلب هذا البروتوكول تخدير العينة. يمكن أخذ عينات منه وتحريره بسرعة بأقل قدر من المناولة. أكياس العينات القابلة لإعادة الإغلاق منخفضة التكلفة وسهلة الحصول عليها وخفيفة الوزن ومحمولة للغاية وقابلة لإعادة التدوير ، مما يجعلها بديلا رائعا لأنابيب أجهزة الطرد المركزي. نظرا لأنها تفتقر إلى صلابة بعض البدائل (على سبيل المثال ، أنابيب الصقر أو الحاويات الصلبة الأخرى) ، فمن المهم توخي الحذر الشديد عند التعامل مع عينات الحشرات الحية. إذا كان سيتم أخذ عينة كاملة كقسيمة ، فإن وضعها في حاوية متينة سيقلل من الضرر المحتمل للعينة.

من المفيد للباحثين الذين يستخدمون هذه الطريقة أن يكون لديهم خبرة في التعامل مع النحل و / أو الحشرات الأخرى لأن الضغط المفرط على العينات أثناء وجودها في الكيس قد يؤدي إلى الإصابة أو الوفاة. للحصول على مزيد من الخبرة في التعامل مع النحل ، يجب على الباحثين المبتدئين ممارسة هذا البروتوكول باستخدام أنواع أكثر شيوعا (مثل نحل العسل). ستساعد الممارسة في تقليل إصابة الحشرة أو نفوقها. ومن المهم ملاحظة أنه قد تكون هناك قيود على هذه المنهجية، تبعا للتصنيف البؤري. قد يتطلب الحجم المنخفض لأصناف معينة استخدام معدات تصوير ماكرو أكثر تكلفة وتخصصا و / أو استخدام المجاهر الميدانية حيث قد لا يكون من الممكن عزل ميزاتها وتصويرها بالمواد المدرجة في هذا الإجراء ، فكلما كان الهدف أصغر ، زادت صعوبة الحصول على صور كافية³⁷. بالإضافة إلى ذلك ، في الحالات التي تتطلب أجزاء من الجسم يتعذر الوصول إليها (مثل اللسان والأعضاء التناسلية وما إلى ذلك) ، قد يكون هناك ما يبرر طرق أخرى لتحديد الهوية. الأعضاء التناسلية هي من بين السمات التشخيصية الأكثر إفادة للحشرات ، والتي يمكن أن تكون متغيرة للغاية بين الأنواع ومستقرة إلى حد ما داخلها^38،39. في هذه الحالة ، قد تكون الطرق المميتة ، مثل التشريح ، ضرورية. ومع ذلك ، بالنسبة للأنواع التي يصعب التعرف عليها ، يمكن استخدام عينات وراثية صغيرة غير مميتة لتحديد الهوية بعد الجمع الميداني⁴⁰ ، ويمكن استخدام المنهجية الموضحة هنا لجمع هذه العينات. يتم أيضا تطوير النمذجة الإحصائية للمساعدة في ربط التصوير وتسلسل الحمض النووي لتحديد الحشرات⁴¹.

هناك قيد آخر للمنهجية المعروضة هنا يتعلق باحتمال التعرض للدغة عند تنفيذ هذا البروتوكول ، خاصة عند وجود ثقب في الحقيبة. ومع ذلك ، يقلل هذا البروتوكول من احتمالية التعرض للسع. نادرا ما تعرض المؤلفون للسع من خلال أكياس العينات أثناء التعامل مع العينات. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن بعض أنواع النحل والخنافس والدبابير تمكنت من قطع الأكياس باستخدام الفك السفلي ، لذلك يجب توخي الحذر عند تحديد ما إذا كان هذا النهج سيعمل مع الأصناف ذات الأهمية ، وفي هذه الحالات ، يوصى باستخدام أكياس بلاستيكية أكثر سمكا أو منهجيات أخرى. في جميع الحالات ، يجب على المستخدمين تقليل استخدام المواد البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة وإعادة تدويرها عندما يكون ذلك ممكنا.

كان التصنيف البؤري لتطوير هذا البروتوكول هو نحلة الكالامينثا الزرقاء ، Osmia calaminthae (غشائيات الأجنحة: Megachilidae) ، والتي يبلغ حجمها حوالي 10-11 مم^{في الحجم 32}. منذ تطوير هذه الطريقة ، استخدمها المؤلفون على مجموعة متنوعة من غشاء البكارة الأخرى بأحجام مختلفة ، بما في ذلك أنواع Bombus الأكبر (Hymnenoptera: Apidae) وأنواع Caupolicana ، C. electa و C. floridana (غشائيات الأجنحة: Colletidae). يمكن أن تختلف Caupolicana electa من 18-23 مم ، بينما يمكن أن تختلف C. floridana من 16-18 مم³³. للمساعدة في تقليل أي آثار سلبية على الأنواع المعرضة للخطر أو المعرضة للخطر أو المدرجة في القائمة ، يوصى بتجربتها على البدائل ذات الصلة الوثيقة و / أو الشائعة أولا للمساعدة في اكتساب الخبرة وبناء الكفاءة. يمكن أن يختلف الهيكل الخارجي للنحل والحشرات الأخرى ، ويجب التعامل مع العينات الأقل قوة بعناية. في الحالات التي تتم فيها دراسة أجسام أصغر أو أكثر ليونة من الحشرات ، قد لا تكون هذه المنهجية كافية. يجب على المستخدمين تحديد أجزاء هذه المنهجية التي ستكون مناسبة لتصنيفهم البؤري.

بالإضافة إلى الهدف الأساسي المتمثل في حصر الكائنات الحية التي تم جمعها ميدانيا لتحديد هويتها ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لأداء العديد من المهام المتعلقة بالبحث التي يحتاج النحل إلى حصرها بأمان. على سبيل المثال ، يمكن وزن الكائنات الحية في الحقل أثناء وجودها في أكياس العينات القابلة لإعادة الإغلاق. يمكن للباحثين أيضا أخذ قياسات مختلفة للعينات باستخدام الفرجار أثناء تقييد الحشرة. على سبيل المثال ، يمكن تقدير قدرة النحل على توجيه النحل باستخدام حجم الجسم⁴² ؛ يمكن أن تساعد منهجيتنا في الحصول على البيانات التي من شأنها تسهيل هذا التقدير. وبالمثل ، بدلا من استخدام الفرجار ، يمكن للباحثين وضع وتصوير مسطرة / شريط مقياس و / أو بطاقة ملونة خلف العينة مباشرة لقياس السمات المورفولوجية الرئيسية عند معالجة الصور لاحقا. يمكن للتطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة الاستفادة من التقدم في الذكاء الاصطناعي والتعلم الآلي. يمكن تبسيط تحديد الهوية ، سواء في الميدان أو في المختبر ، باستخدام الأجهزة الذكية ، وبالتالي تقليل وقت المناولة والضغط على العينات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos