زرع الخلايا عالية الدقة في الزرد الجنيني واليرقات

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لزرع الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية في أجنة الزرد واليرقات في أي مرحلة بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب.

Abstract

يحدث التطور والتجديد من خلال عملية التفاعلات الخلوية الديناميكية المكانية الزمانية المشفرة وراثيا. يعد استخدام زرع الخلايا بين لتتبع مصير الخلية وإحداث عدم تطابق في الخصائص الجينية أو المكانية أو الزمانية للخلايا المانحة والمضيفة وسيلة قوية لفحص طبيعة هذه التفاعلات. قدمت الكائنات الحية مثل الفرخ والبرمائيات مساهمات حاسمة في فهمنا للنمو والتجديد ، على التوالي ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قابليتها للزرع. ومع ذلك ، كانت قوة هذه النماذج محدودة بسبب انخفاض قابلية السحب الجيني. وبالمثل ، فإن الكائنات الحية النموذجية الجينية الرئيسية لديها قابلية أقل للزرع.

يعتبر الزرد نموذجا وراثيا رئيسيا للتطور والتجديد ، وعلى الرغم من أن زرع الخلايا شائع في الزرد ، إلا أنه يقتصر عموما على نقل الخلايا غير المتمايزة في المراحل المبكرة من تطور البلاستولا والمعدة. في هذه المقالة ، نقدم طريقة بسيطة وقوية تمتد نافذة زراعة الزرد إلى أي مرحلة جنينية أو يرقية بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب. تسمح دقة هذا النهج بزرع أقل من خلية واحدة بدقة مكانية وزمانية شبه مثالية في كل من المانحة والمضيفة. بينما نسلط الضوء هنا على زرع الخلايا العصبية الجنينية واليرقات لدراسة تطور الأعصاب وتجديدها ، على التوالي ، فإن هذا النهج ينطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا السلفية والمتمايزة وأسئلة البحث.

Introduction

زرع الخلايا له تاريخ طويل وحافل كتقنية أساسية في علم الأحياء التنموي. في مطلع^{القرن العشرين} ، حولت الأساليب التي تستخدم التلاعب الجسدي لإزعاج العملية التنموية ، بما في ذلك الزرع ، علم الأجنة من علم قائم على الملاحظة إلى علم تجريبي ^1,2. في إحدى التجارب التاريخية، قام هانز سبيمان وهيلدا مانغولد بزرع الشفة الظهرية لجنين السمندل على الجانب الآخر من الجنين المضيف، مما أدى إلى تحفيز الأنسجة القريبة على تشكيل محور جسم ثانوي³. أظهرت هذه التجربة أن الخلايا يمكن أن تحفز الخلايا الأخرى على تبني مصائر معينة ، وبعد ذلك ، تم تطوير عملية الزرع كطريقة قوية لا....

Protocol

تمت الموافقة على جميع جوانب هذا الإجراء المتعلقة بالعمل مع الزرد الحي من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة مينيسوتا (IACUC) ويتم تنفيذها وفقا لإرشادات IACUC.

1. الإعداد الأولي لمرة واحدة لجهاز الزرع (الشكل 1)

1. قم بتجميع مجهر الزرع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجهرا مضانا رأسيا بهدف غمس الماء 40x.
2. قم بتجميع المعالجات الدقيقة الخشنة والدقيقة وقم بتركيبها على الجانب الأيمن من المجهر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: نظرا لأنه من المهم ألا تتحرك المرحلة في البعد Z بالنسبة للإبرة ، فإ....

النتائج

تتم ملاحظة نتائج تجارب الزرع مباشرة من خلال تصور الخلايا المانحة ذات العلامات الفلورية في المضيفة في نقاط زمنية مناسبة بعد الزرع باستخدام مجهر مضان. هنا ، قمنا بزرع الخلايا العصبية المبهمة الأمامية الفردية عند 3 dpf. ثم تم تحضين المضيفة لمدة 12 أو 48 ساعة ، وتخديرها ، وتركيب?.......

Discussion

اعتمدت البيولوجيا التنموية والتجديدية لأكثر من قرن على تجارب الزرع لفحص مبادئ إشارات الخلية وتحديد مصير الخلية. يمثل نموذج الزرد بالفعل اندماجا قويا للنهج الجينية وزراعة الأعضاء. يعد الزرع في مرحلتي البلاستولا والمعدة لتوليد الفسيفساء أمرا شائعا ولكنه محدود في أنواع ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010