JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لزرع الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية في أجنة الزرد واليرقات في أي مرحلة بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب.

Abstract

يحدث التطور والتجديد من خلال عملية التفاعلات الخلوية الديناميكية المكانية الزمانية المشفرة وراثيا. يعد استخدام زرع الخلايا بين لتتبع مصير الخلية وإحداث عدم تطابق في الخصائص الجينية أو المكانية أو الزمانية للخلايا المانحة والمضيفة وسيلة قوية لفحص طبيعة هذه التفاعلات. قدمت الكائنات الحية مثل الفرخ والبرمائيات مساهمات حاسمة في فهمنا للنمو والتجديد ، على التوالي ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قابليتها للزرع. ومع ذلك ، كانت قوة هذه النماذج محدودة بسبب انخفاض قابلية السحب الجيني. وبالمثل ، فإن الكائنات الحية النموذجية الجينية الرئيسية لديها قابلية أقل للزرع.

يعتبر الزرد نموذجا وراثيا رئيسيا للتطور والتجديد ، وعلى الرغم من أن زرع الخلايا شائع في الزرد ، إلا أنه يقتصر عموما على نقل الخلايا غير المتمايزة في المراحل المبكرة من تطور البلاستولا والمعدة. في هذه المقالة ، نقدم طريقة بسيطة وقوية تمتد نافذة زراعة الزرد إلى أي مرحلة جنينية أو يرقية بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب. تسمح دقة هذا النهج بزرع أقل من خلية واحدة بدقة مكانية وزمانية شبه مثالية في كل من المانحة والمضيفة. بينما نسلط الضوء هنا على زرع الخلايا العصبية الجنينية واليرقات لدراسة تطور الأعصاب وتجديدها ، على التوالي ، فإن هذا النهج ينطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا السلفية والمتمايزة وأسئلة البحث.

Introduction

زرع الخلايا له تاريخ طويل وحافل كتقنية أساسية في علم الأحياء التنموي. في مطلعالقرن العشرين ، حولت الأساليب التي تستخدم التلاعب الجسدي لإزعاج العملية التنموية ، بما في ذلك الزرع ، علم الأجنة من علم قائم على الملاحظة إلى علم تجريبي 1,2. في إحدى التجارب التاريخية، قام هانز سبيمان وهيلدا مانغولد بزرع الشفة الظهرية لجنين السمندل على الجانب الآخر من الجنين المضيف، مما أدى إلى تحفيز الأنسجة القريبة على تشكيل محور جسم ثانوي3. أظهرت هذه التجربة أن الخلايا يمكن أن تحفز الخلايا الأخرى على تبني مصائر معينة ، وبعد ذلك ، تم تطوير عملية الزرع كطريقة قوية لاستجواب الأسئلة الحرجة في علم الأحياء التنموي فيما يتعلق بالكفاءة وتحديد مصير الخلية ، ونسب الخلية ، والقدرة الاستقرائية ، واللدونة ، وقوة الخلايا الجذعية1،4،5.

وقد وسعت التطورات العلمية الحديثة من قوة نهج الزرع. في عام 1969 ، سمح اكتشاف نيكول لو دواران أن تلطيخ النواة يمكن أن يميز الأنواع الأصلية في كيميرا كتكوت السمان بتتبع الخلايا المزروعة وذريتها6. تم تعزيز هذا المفهوم لاحقا من خلال ظهور علامات الفلورسنت المعدلة وراثيا وتقنيات التصوير المتقدمة5 ، وتم الاستفادة منه لتتبع مصير الخلية 6,7 ، وتحديد الخلايا الجذعية وقوتها 8,9 ، وتتبع حركات الخلايا أثناء نمو الدماغ10. بالإضافة إلى ذلك ، سهل ظهور علم الوراثة الجزيئية عملية الزرع بين المضيفين والمتبرعين بالأنماط الجينية المتميزة ، مما يدعم التشريح الدقيق للوظائف المستقلة وغير المستقلة للعوامل التنموية11.

قدمت عملية الزرع أيضا مساهمات مهمة في دراسة التجدد ، لا سيما في الكائنات الحية ذات القدرات التجديدية القوية مثل المستوية و axolotl ، من خلال توضيح الهويات الخلوية والتفاعلات التي تنظم نمو ونمط الأنسجة المتجددة. كشفت دراسات الزرع عن مبادئ الفاعلية12 ، والأنماط المكانية 13,14 ، ومساهمات الأنسجة المحددة15,16 ، وأدوار الذاكرة الخلوية12,17 في التجديد.

الزرد هو نموذج الفقاريات الرائد لدراسة التطور والتجديد ، بما في ذلك في الجهاز العصبي ، بسبب برامجه الوراثية المحفوظة ، وقابلية السحب الوراثية العالية ، والإخصاب الخارجي ، وحجم القابض الكبير ، والوضوح البصري18،19،20. الزرد هي أيضا قابلة للغاية للزرع في مراحل النمو المبكرة. النهج الأبرز هو زرع الخلايا من جنين متبرع مسمى إلى جنين مضيف في مرحلة البلاستولا أو المعدة لتوليد الفسيفساء. سوف تتشتت الخلايا المزروعة خلال مرحلة البلاستولا وتتشتت مع بدء epiboly ، مما ينتج عنه فسيفساء من الخلايا والأنسجة الموسومة عبر الجنين21. تسمح عمليات زرع المعدة ببعض الاستهداف للخلايا المزروعة وفقا لخريطة مصير تقريبية حيث يتشكل الدرع ويمكن تحديد محاور A-P و D-V21. كانت الفسيفساء الناتجة ذات قيمة في تحديد ما إذا كانت الجينات تعمل بشكل مستقل ، واختبار التزام الخلية ، ورسم خرائط حركة الأنسجة وهجرة الخلايا طوال فترة التطوير 5,11. يمكن توليد الزرد الفسيفسائي بعدة طرق ، بما في ذلك التثقيب الكهربائي22 ، وإعادة التركيب23 ، و F0 التحوير24 والطفرات25 ، لكن الزرع يوفر أكبر قدر من التلاعب والدقة في المكان والزمان وعدد وأنواع الخلايا. تقتصر الحالة الحالية لزراعة الزرد إلى حد كبير على الخلايا السلفية في المراحل المبكرة ، مع استثناءات قليلة بما في ذلك زرع الخلايا العصبية الحركية الشوكية26,27 ، وخلايا العقدة الشبكية28,29 ، وخلايا القمة العصبية في أول 10-30 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 30 ، والخلايا المكونة للدم والخلايا السرطانية في الزرد البالغ 5,31. إن توسيع طرق الزرع لتشمل مجموعة واسعة من الأعمار ومراحل التمايز وأنواع الخلايا من شأنه أن يعزز بشكل كبير قوة هذا النهج لتوفير رؤى حول عمليات النمو والتجدد.

هنا ، نعرض تقنية مرنة وقوية لزراعة الخلايا عالية الدقة فعالة في أجنة الزرد واليرقات حتى 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب. يمكن استخدام الأسماك المضيفة والمانحة المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في الأنسجة المستهدفة لاستخراج الخلايا المفردة وزرعها بدقة مكانية وزمانية شبه مثالية. يسمح الوضوح البصري لأجنة ويرقات الزرد بتصوير الخلايا المزروعة حية أثناء تطور المضيف أو تجديده. تم استخدام هذا النهج سابقا لدراسة كيفية تأثير ديناميكيات الإشارات الزمانية المكانية على الهوية العصبية وتوجيه المحور العصبي في الجنين32 ، وفحص المنطق الذي تعزز به العوامل الجوهرية والخارجية توجيه المحور العصبي أثناء التجدد في أسماك اليرقات33. بينما نركز هنا على زرع الخلايا العصبية المتمايزة ، فإن طريقتنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على كل من أنواع الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة عبر العديد من المراحل والأنسجة لمعالجة الأسئلة في التطوير والتجديد.

Protocol

تمت الموافقة على جميع جوانب هذا الإجراء المتعلقة بالعمل مع الزرد الحي من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة مينيسوتا (IACUC) ويتم تنفيذها وفقا لإرشادات IACUC.

1. الإعداد الأولي لمرة واحدة لجهاز الزرع (الشكل 1)

  1. قم بتجميع مجهر الزرع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجهرا مضانا رأسيا بهدف غمس الماء 40x.
  2. قم بتجميع المعالجات الدقيقة الخشنة والدقيقة وقم بتركيبها على الجانب الأيمن من المجهر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: نظرا لأنه من المهم ألا تتحرك المرحلة في البعد Z بالنسبة للإبرة ، فإننا نستخدم مجهرا ثابتا المرحلة مع معالجات دقيقة مثبتة على قاعدة المجهر. في حالة عدم توفر مجهر المرحلة الثابتة ، يمكن تركيب المعالج الدقيق على المسرح.
  3. قم بتوصيل حامل القطب الدقيق بمقبض القطب ، وقم بتثبيته على المناور الدقيق.
  4. قم بتوصيل جانب واحد من المحبس ثلاثي الاتجاهات بمضخة الحقن الدقيقة. قم بتوصيل الجانب الآخر من المحبس بأنبوب البولي إيثيلين باستخدام محول الكروماتوغرافيا.
  5. قم بتوصيل الجانب الآخر من أنبوب البولي إيثيلين بحامل القطب الدقيق باستخدام محول الكروماتوغرافيا.
  6. املأ حقنة الخزان سعة 10 مل بزيت معدني خفيف وقم بتركيبها على الجانب العلوي من المحبس.
  7. املأ مضخة الحقن الدقيقة والأنابيب (الخط الهيدروليكي) بالزيت المعدني من الخزان ، مع التأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء.
    ملاحظة: بمجرد إعداد الجهاز ، سيتطلب الأمر صيانة عرضية فقط للخط الهيدروليكي. يمكن إزالة حقنة الخزان وإعادة تعبئتها بالزيت المعدني حسب الضرورة.

2. إعداد دافعات الأجنة.

  1. قطع قطعة 2 سم من خط الصيد وأدخله جزئيا في الطرف الضيق لطرف ماصة P1000 ، وترك ~ 1.5 سم مكشوفا. تأمين خط الصيد مع قطرة صغيرة من superglue والسماح ليجف.

3. إعداد الحلول.

  1. لتحضير 1٪ من الأغاروز ذو درجة انصهار منخفضة مذاب في وسط الجنين (LMA) ، قم بإذابة الأغاروز في وسائط الجنين المغلي34. اصنع 1-2 مل من القسوم في أنابيب اختبار مستديرة القاع واحفظها عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإعداد محلول رينغر مع البنسلين والستربتومايسين والتريكائين (RPT) عن طريق الجمع بين المكونات التالية إلى التركيزات النهائية 116 مليمتر كلوريد الصوديوم ، 2.9 ملليمتر KCl ، 1.8 mM CaCl2 ، 5 mM HEPES pH 7.2 ، 50 وحدة / مل من البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، مع التحريك حتى يذوب ، ويمر عبر مرشح فراغ. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. أضف التريكايين مباشرة قبل الاستخدام بتركيز 0.02٪.

4. إعداد المانحة والمضيفة للزراعة.

  1. تربية المضيفة والمتبرعة من الأنماط الوراثية المناسبة ، مع الخلايا ذات الأهمية الموسومة بالفلورسنت ، إلى العمر المطلوب.
    ملاحظة: بالنسبة لعمليات الزرع هذه ، استخدمنا Tg (isl1: EGFPCAAX) fh474 المانحة32 و Tg (isl1: mRFP) fh1 المضيفة35 والخلايا العصبية المزروعة من المتبرع إلى النوى الحركية المبهمة المضيفة عند 3dpf.
  2. قم بإعداد شرائح الزرع عن طريق تطبيق مخطط مستطيل من طلاء الأظافر الشفاف على كل شريحة زجاجية (الشكل 2 أ). يخلق طلاء الأظافر حاجزا كارها للماء للاحتفاظ به في RPT المضاف في الخطوة 4.8. اتركيه حتى يجف تماما قبل الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن إعداد الشرائح مسبقا وتخزينها إلى أجل غير مسمى.
  3. قم بإذابة حصة LMA واحدة عن طريق وضع أنبوب من LMA في دورق سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من الماء ووضعه في الميكروويف لمدة 1 دقيقة بقوة 50٪ أو حتى يذوب. حافظ على LMA عند 40 درجة مئوية في سخان الحمام الجاف.
  4. قم بإزالة المضيفة والمانحة بالملقط (إن أمكن) وتخديرها عن طريق وضعها في أطباق بتري صغيرة مليئة ب RPT بدرجة حرارة الغرفة. انتظر 5 دقائق حتى يتم تخدير بالكامل قبل المتابعة.
  5. قم بتركيب المانحة والمضيفة الفردية: باستخدام ماصة باستور ومضخة الماصة ، انقل من RPT إلى LMA ، ثم انقل في قطرات صغيرة من LMA إلى شرائح داخل مخطط طلاء الأظافر. قلل من كمية RPT المنقولة إلى LMA حتى لا يتم تخفيف LMA. قبل أن يصلب LMA ، استخدم دافع الأجنة لتوجيه ، مع التأكد من أن كل مركب مع موقع إدخال الإبرة المقصود إلى اليمين ، وجميع محاذاة عموديا (الشكل 2B) ؛ اسمح للأغاروز بالتثبيت الكامل (~ 5 دقائق) قبل المتابعة.
    ملاحظة: نظرا لأنه يمكن أخذ العديد من الخلايا من كل متبرع ، فمن الأفضل تركيب 2-4 مضيفة مع متبرع واحد على كل شريحة.
  6. باستخدام مشرط ، قم بقطع شريحة عمودية مستقيمة من خلال جميع قطرات الأغاروز على يمين المركبة (الشكل 2 ج). إزالة agarose فضفاضة من الشريحة مع مناديل المختبر.
  7. باستخدام مشرط ، اقطع أسافين من الأغاروز لفضح موقع إدخال الإبرة (الشكل 2 ج). إزالة agarose فضفاضة من الشريحة مع مناديل المختبر.
  8. ضع RPT على الشريحة حتى تغمر قطرات الأغاروز بالكامل (الشكل 2 د).
  9. قم بتركيب الشريحة المعدة على مجهر الزرع. ضع المتبرع في بؤرة التركيز تحت هدف 40x. للقيام بذلك ، قم بخفض الهدف حتى يكسر سطح الوسائط ، ثم ارفع الهدف إلى المستوى البؤري المطلوب.
    ملاحظة: يجب الحفاظ على ملامسة السائل بالهدف حتى اكتمال عملية الزرع (الشكل 3C).
  10. التركيز على خلية (خلايا) المانحين ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية ؛ بعد ذلك ، حرك المرحلة إلى اليسار استعدادا لتحديد موقع إبرة الزرع.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، لا تقم بضبط المجهر على المحاور Y أو Z ، للتأكد من أنه يمكنك بسهولة إعادة العثور على المتبرع في القسم 5.

5. تحضير إبرة الزرع.

  1. أدخل ماصة صغيرة في مجتذب الماصة الدقيقة واسحب إبرة الحقن المجهري.
    ملاحظة: يجب أن يكون شكل الإبرة مشابها لتلك المستخدمة في حقن جنين الزرد في مرحلة 1 خلية أو لقط التصحيح. نستخدم مجتذب ماصة صغيرة مع البرنامج التالي: الضغط = 500 ، الحرارة = المنحدر + 80 ، السحب = 90 ، السرعة = 70 ، الوقت = 250 (انظر جدول المواد) ، على الرغم من أن الإعدادات الصحيحة لكل مجتذب من المحتمل أن تحتاج إلى تحديد تجريبي.
  2. قم بمحاذاة طرف الإبرة مع أقسام ميكرومتر المرحلة تحت نطاق تشريح. باستخدام الميكرومتر كدليل قياس ، استخدم زوجا حادا من الملقط لكسر الإبرة إلى حجم تجويف أكبر قليلا من قطر الخلايا ذات الأهمية (الشكل 3 أ). تأكد من أن الكسر نظيف قدر الإمكان ، حيث يمكن أن تساهم الحواف الخشنة في انسداد الإبرة. ملاحظة: بالنسبة للخلايا العصبية الحركية المبهمة (قطرها 5-7 ميكرومتر) ، يجب كسر الإبر إلى قطر داخلي يبلغ 10 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع قطر خارجي يبلغ 20 ميكرومتر. إذا لزم الأمر ، يمكن تحسين حجم و / أو شكل و / أو زاوية طرف الإبرة باستخدام microforge أو microgrinder36.
  3. باستخدام حقنة سعة 50 مل مملوءة بزيت معدني خفيف ومجهزة بحشو ماصة ، املأ الإبرة بالكامل بالزيت المعدني (الشكل 3 ب). تأكد من عدم وجود فقاعات هواء. ضع الإبرة المملوءة جانبا حتى تصبح جاهزة للتركيب.
    ملاحظة: لضمان عدم وجود فقاعات هواء ، أدخل حشو الماصة بالكامل في الإبرة وحرر الزيت أثناء سحب الحشو ببطء من الإبرة.
  4. على جهاز الزرع ، أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات بحيث يواجه ذراعه الطويل مضخة الحقن الدقيقة واضغط على مكبس حقنة الخزان لطرد جميع فقاعات الهواء من الخط الهيدروليكي. حافظ على الضغط الخفيف على المكبس (لمنع ارتجاع الهواء إلى الخط) وأدر المحبس ثلاثي الاتجاهات بحيث يواجه ذراعه الطويل حقنة الخزان.
  5. أدخل الإبرة في الحامل ، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء. اضبط زاوية الإبرة بحيث تواجه اليسار مباشرة بزاوية 10-15 درجة من الأفقي (الشكل 3C).
  6. استخدم المعالجات الدقيقة الخشنة والدقيقة لمناورة طرف الإبرة تحت هدف المجهر والتركيز عليها (الشكل 3 د).
    ملاحظة: يمكن إجراء الموضع الخشن للإبرة في المستويين X و Y عن طريق المراقبة المباشرة للمنطقة الموجودة أسفل الهدف أثناء مناورة الإبرة ، حيث ستعكس الإبرة شعاع الضوء المرسل عند وضعه تحت الهدف. يمكن بعد ذلك استخدام عدسات المجهر لتحديد المواقع بدقة. لا تقم بضبط موضع مرحلة المجهر أو التركيز أثناء هذه الخطوة. استخدم المعالجات الدقيقة لإحضار طرف الإبرة إلى الموضع البؤري الحالي.
  7. إذا كان السائل يتدفق داخل أو خارج طرف الإبرة ، فاضبط الضغط باستخدام مضخة المحقنة حتى يتم ملاحظة هلالة مستقرة بين الزيت المعدني ومحلول رينغر (الشكل 3 د).
    ملاحظة: إذا بقيت فقاعة زيت عند طرف الإبرة بعد التثبيت ، فيمكن إزالتها باستخدام ضبط المستوى X على جهاز التحكم الدقيق الخشن لتحريك الإبرة إلى اليمين حتى يتم سحب طرفها من RPT ، ثم العودة إلى اليسار حتى يتم إعادة وضعها تحت الهدف.

6. الزرع

ملاحظة: يجب أن تتم جميع حركات الإبرة باستخدام المعالج الدقيق الدقيق لهذا القسم.

  1. حرك المسرح إلى اليمين حتى يتم إعادة المتبرع إلى العرض ، مع توخي الحذر لتجنب الاختراق العرضي بالإبرة.
  2. أعد التركيز وركز على الخلايا المراد زرعها وقم بمحاذاة الإبرة مع الخلايا الموجودة خارج مباشرة (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: قد تحتاج إلى التبديل بين برايتفيلد والتألق في كثير من الأحيان لضمان المحاذاة المناسبة. يمكن أن يساعد استخدام مرشح الكثافة المحايدة في تصور كليهما في وقت واحد.
  3. أدخل الإبرة في المانح.
    ملاحظة: يمكن أن تساعد حركات الدخول والخروج المتكررة بالإبرة في اختراق الجلد.
  4. أعد تثبيت الغضروف المفصلي الزيتي في طرف الإبرة على الفور باستخدام مضخة الحقن المجهرية ، كما هو موضح في الخطوة 5.7.
  5. ضع طرف الإبرة على الخلايا ذات الأهمية وقم بتطبيق شفط لطيف باستخدام مضخة الحقن الدقيقة (الشكل 4 ب).
    ملاحظة: يمكن أن تساعد حركات الدخول والخروج اللطيفة أثناء الشفط على تخفيف الخلايا.
  6. عندما يتم تناول عدد كاف من الخلايا ، قم بإزالة الإبرة من المتبرع وأعد تثبيت الغضروف المفصلي الزيتي في طرف الإبرة على الفور باستخدام مضخة الحقن المجهرية.
  7. احرص على تجنب ملامسة أو الأغاروز بالإبرة ، قم بتغيير موضع المسرح لإبراز أول مضيف.
  8. توسيط وتركيز المنطقة التي سيتم وضع الخلايا فيها ومحاذاة الإبرة مع هذه المنطقة خارج مباشرة (الشكل 4C).
  9. أدخل الإبرة في المضيف وأعد تثبيت الغضروف المفصلي للزيت على الفور في طرف الإبرة باستخدام مضخة الحقن الدقيقة.
  10. ضع طرف الإبرة في موقع الترسيب واضغط برفق باستخدام مضخة الحقن الدقيقة حتى يتم إطلاق العدد الصحيح من خلايا المتبرع من الإبرة (الشكل 4 د).
    ملاحظة: إذا تم تمييز الخلايا المانحة والمضيفة بفلوروفورات مختلفة ، فإن المرشح متعدد النطاقات للسماح بالتصور المتزامن يمكن أن يكون مفيدا جدا في هذه المرحلة.
  11. قم بإزالة الإبرة من المضيف وأعد تثبيت الغضروف المفصلي الزيتي على الفور في طرف الإبرة باستخدام مضخة الحقن الدقيقة.
  12. كرر الخطوات 6.7-6.11 لكافة المضيفين المتبقين.

7. استعادة المضيفة

  1. ارفع هدف 40x واستخدم المناور الدقيق الخشن لمناورة الإبرة مرة أخرى إلى وضع التحميل.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الإبرة لشرائح متعددة.
  2. قم بإزالة الشريحة من مجهر الزرع وضعها تحت مجهر تشريح.
  3. قم بفك المضيفة عن طريق إزالتها بعناية من قطرة LMA بالملقط. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، انقل المضيفة إلى طبق بمحلول رينجر الطازج مع البنسلين / الستربتومايسين. تأكد من أن تتعافى من التخدير وتحتفظ بها في حاضنة الأجنة حتى تصبح جاهزة للتصوير. القتل الرحيم للحيوانات المانحة وفقا للبروتوكولات المعتمدة.
    ملاحظة: طريقتنا للقتل الرحيم هي غمر في حمام جليدي لمدة 1 ساعة على الأقل تليها الغمر في 500 ملغ / لتر هيبوكلوريت الصوديوم.

النتائج

تتم ملاحظة نتائج تجارب الزرع مباشرة من خلال تصور الخلايا المانحة ذات العلامات الفلورية في المضيفة في نقاط زمنية مناسبة بعد الزرع باستخدام مجهر مضان. هنا ، قمنا بزرع الخلايا العصبية المبهمة الأمامية الفردية عند 3 dpf. ثم تم تحضين المضيفة لمدة 12 أو 48 ساعة ، وتخديرها ، وتركيب?...

Discussion

اعتمدت البيولوجيا التنموية والتجديدية لأكثر من قرن على تجارب الزرع لفحص مبادئ إشارات الخلية وتحديد مصير الخلية. يمثل نموذج الزرد بالفعل اندماجا قويا للنهج الجينية وزراعة الأعضاء. يعد الزرع في مرحلتي البلاستولا والمعدة لتوليد الفسيفساء أمرا شائعا ولكنه محدود في أنواع ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نشكر سيسيليا موينز على التدريب على زراعة الزرد. مارك تاي لرعاية الأسماك الممتازة ؛ وإيما كارلسون للحصول على تعليقات على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة NS121595 إلى A.J.I.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL "reservoir syringe"Fisher Scientific14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PESCorning431153
20 x 12 mm heating blockCorning480122
3-way stopcockBraun Medical Inc.455991
3 x 1 Frosted glass slideVWR48312-004
40x water dipping objectiveNikonMRD07420
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Coarse ManipulatorNarishigeMN-4
Custom microsyringe pumpUniversity of OregonN/AManufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"NikonN/A
electrode handleWorld Precision Instruments5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11VWR21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic NarishigeMMO-203
HEPES pH 7.2Sigma-AldrichH3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel HandleFisher Scientific12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 inDWK Life Sciences63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter DWK Life Sciences420408-0000
KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Light Mineral OilSigma-AldrichM3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 VCorning6875SB
Manual microsyringe pumpWorld Precision InstrumentsMMPCommercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode HolderWorld Precision InstrumentsMPH310
MicroFil Pipette FillerWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Nail PolishElectron MIcroscopy Sciences72180
Nuclease-free waterVWR82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97
Penicillin-streptomycinSigma-Aldrichp4458-100ML5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mLBel-Art37898-0000
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Professional Super GlueLoctiteLOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test TubesFalcon352054
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Stage micrometerMeiji Techno AmericaMA285
Syringes without Needle, 50 mLBD Medical309635
Tricaine MethanosulfonateSyndel USASYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing lineBerkleyXLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205BD Medical427445
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
Wiretrol II calibrated micropipettesDrummond50002010

References

  1. Solini, G. E., Dong, C., Saha, M. Embryonic transplantation experiments: Past, present, and future. Trends Dev Biol. 10, 13-30 (2017).
  2. Gilbert, S. F. . A Conceptual History of Modern Embryology. , (1991).
  3. Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. 1923. Int J Dev Biol. 45 (1), 13-38 (2001).
  4. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage Tracing. Cell. 148 (1), 33-45 (2012).
  5. Gansner, J. M., Dang, M., Ammerman, M., Zon, L. I. Chapter 22 - Transplantation in zebrafish. Methods in Cell Biol. 138, 629-647 (2017).
  6. Le Douarin, N. Details of the interphase nucleus in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). Bull Biol Fr Belg. 103 (3), 435-452 (1969).
  7. Ho, R. K. Cell movements and cell fate during zebrafish gastrulation. Dev Suppl. , 65-73 (1992).
  8. Le Douarin, N. M. Developmental patterning deciphered in avian chimeras. Development, Growth & Differentiation. 50, S11-S28 (2008).
  9. Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332 (6031), 811-816 (2011).
  10. Balaban, E., Teillet, M. A., Le Douarin, N. Application of the quail-chick chimera system to the study of brain development and behavior. Science. 241 (4871), 1339-1342 (1988).
  11. Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39 (3), 228-238 (2006).
  12. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  13. Rojo-Laguna, J. I., Garcia-Cabot, S., Saló, E. Tissue transplantation in planarians: A useful tool for molecular analysis of pattern formation. Semin Cell Dev Biol. 87, 116-124 (2019).
  14. Tanaka, E. M. The molecular and cellular choreography of appendage regeneration. Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).
  15. Hu, Y., et al. Muscles are barely required for the patterning and cell dynamics in axolotl limb regeneration. Front Genet. 13, 1036641 (2022).
  16. Wells, K. M., Kelley, K., Baumel, M., Vieira, W. A., McCusker, C. D. Neural control of growth and size in the axolotl limb regenerate. Elife. 10, e68584 (2021).
  17. Otsuki, L., Tanaka, E. M. Positional memory in vertebrate regeneration: a century's insights from the salamander limb. Cold Spring Harb Perspect Biol. 14 (6), e040899 (2022).
  18. de Abreu, M. S., et al. Zebrafish as a model of neurodevelopmental disorders. Neuroscience. 445, 3-11 (2020).
  19. Alper, S. R., Dorsky, R. I. Unique advantages of zebrafish larvae as a model for spinal cord regeneration. Front Mol Neurosci. 15, 983336 (2022).
  20. Blader, P., Strähle, U. Zebrafish developmental genetics and central nervous system development. Hum Mol Genet. 9 (6), 945-951 (2000).
  21. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  22. Boulanger-Weill, J., et al. Functional interactions between newborn and mature neurons leading to integration into established neuronal circuits. Curr Biol. 27 (12), 1707-1720 (2017).
  23. Dong, J., Stuart, G. W. Transgene manipulation in zebrafish by using recombinases. Methods Cell Biol. 77, 363-379 (2004).
  24. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  25. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  26. Elsen, J. S. Determination of primary motoneuron identity in developing zebrafish embryos. Science. 252 (5005), 569-572 (1991).
  27. Elsen, J. Chapter 5 - Cellular methods: detailed procedure for transplanting single cells. The Zebrafish Book. , (2000).
  28. Poulain, F. E., Gaynes, J. A., Stacher Hörndli, C., Law, M. -. Y., Chien, C. -. B. Analyzing retinal axon guidance in zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 3-26 (2010).
  29. Masai, I., et al. N-cadherin mediates retinal lamination, maintenance of forebrain compartments and patterning of retinal neurites. Development. 130 (11), 2479-2494 (2003).
  30. Raible, D. W., Elsen, J. S. Regulative interactions in zebrafish neural crest. Development. 122 (2), 501-507 (1996).
  31. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  32. Barsh, G. R., Isabella, A. J., Moens, C. B. Vagus motor neuron topographic map determined by parallel mechanisms of hox5 expression and time of axon initiation. Curr Biol. 27 (24), 3812-3825 (2017).
  33. Isabella, A. J., Stonick, J. A., Dubrulle, J., Moens, C. B. Intrinsic positional memory guides target-specific axon regeneration in the zebrafish vagus nerve. Development. 148 (18), 199706 (2021).
  34. Westerfield, M. Chapter 1: General methods for zebrafish care. The Zebrafish Book. , (2000).
  35. Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5 (1), 9 (2010).
  36. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. J Vis Exp. (88), e51595 (2014).
  37. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
  38. Speirs, Z. C., et al. What can we learn about fish neutrophil and macrophage response to immune challenge from studies in zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 148, 109490 (2024).
  39. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  40. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  41. Wienholds, E., Schulte-Merker, S., Walderich, B., Plasterk, R. H. A. Target-selected inactivation of the zebrafish rag1 gene. Science. 297 (5578), 99-102 (2002).
  42. Petrie-Hanson, L., Hohn, C., Hanson, L. Characterization of rag1 mutant zebrafish leukocytes. BMC Immunol. 10, 8 (2009).
  43. Roh-Johnson, M., et al. Macrophage-dependent cytoplasmic transfer during melanoma invasion in vivo. Dev Cell. 43 (5), 549-562 (2017).
  44. Bukrinsky, A., Griffin, K. J. P., Zhao, Y., Lin, S., Banerjee, U. Essential role of spi-1-like (spi-1l) in zebrafish myeloid cell differentiation. Blood. 113 (9), 2038-2046 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved