الثقافة الدبقية المعوية للخيول وتطبيقها على دراسة آلية الالتهاب العصبي في مغص الخيول

Summary

أصبحت الخلايا الدبقية المعوية معروفة بشكل متزايد لأدوارها في التوازن المعوي وعمليات المرض ، بما في ذلك مضاعفات ما بعد الجراحة. يعاني مرضى الخيول الذين يتعافون من شق البطن الاستكشافي الطارئ من مخاطر عالية للإصابة بحالات التهابية بعد الجراحة ، مما يسلط الضوء على أهمية إنشاء ثقافة الخلايا الدبقية الدبقية المعوية المعوية القابلة للتكرار للدراسة.

Abstract

لا تساهم الحالات الالتهابية بعد الجراحة لمغص الخيول (البطن الحاد) في زيادة تكلفة العميل ، وعدم الراحة للمريض ، ووقت الاستشفاء ، ولكن في كثير من الحالات ، تثبت أنها مهددة للحياة. يتم التعرف بشكل متزايد على مجموعة فريدة من الخلايا المعوية ، الخلايا الدبقية المعوية ، لدورها في استشعار بيئة الجهاز الهضمي والتواصل مع أنواع الخلايا المحيطة. قد تكون التفاعلات بين الخلايا الدبقية المعوية والظهارة المعوية حاسمة في تحديد كيف يمكن للدبقية المعوية للخيول تغيير الحاجز المخاطي لتعديل الالتهاب في الصحة والمغص.

لدراسة هذا التفاعل ، نقدم طريقة لإنشاء الثقافات الدبقية المعوية الأولية للخيول من صائم الخيول وتعريض الثقافات لحالات التهابية معروفة بوجودها في المغص. تم الحصول على الثقافات الدبقية المعوية الأولية من الخيول البالغة التي تم قتلها لأسباب لا علاقة لها بالمغص. تم تشريح الزغابات المعوية والصفيحة المخصوصة بشكل دقيق لفضح تحت الغشاء المخاطي. خضع تحت الغشاء المخاطي المعزول للهضم الأنزيمي مع الكولاجيناز والبروتياز وألبومين مصل الأبقار لمدة 2-3 ساعات. بعد ذلك ، أسفر الهضم الميكانيكي الذي يتضمن الطرد المركزي ، والماصات ، ومصافي الخلايا (40-100 ميكرومتر) عن حبيبات تستخدم للطلاء على 0.05 مجم / مل من الآبار المطلية ب poly-L-lysine بتركيز ~ 400,000 خلية / 300 ميكرولتر من الوسائط.

بعد التقاء والمرور الأول ، تعرضت الخلايا الدبقية المعوية بعد ذلك لمؤتلف الخيول IL-1β (0 ، 10 ، 25 نانوغرام) لمدة 24 ساعة. لنمذجة التفاعلات الظهارية الدبقية في وقت المغص ، تمت إضافة الوسط المشروط إما عن طريق التحكم أو الخلايا الدبقية المعوية المعالجة مباشرة إلى الطبقات الأحادية الصائمية للخيول المتجمعة أثناء قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) باستخدام غرفة EndOhm مزدوجة القطب. توضح هذه البيانات واحدا فقط من العديد من التطبيقات المؤثرة المحتملة للثقافة الدبقية المعوية للخيول.

Introduction

مغص الخيول هو أكثر الشكوى الطبية انتشارا للاستشارة الطارئة¹. مع ما يصل إلى 17٪ من تلك الخيول التي تتطلب تصحيحا جراحيا ، يجب أن تكون الجهود المبذولة لزيادة نتائج ما بعد الجراحة في طليعة الأبحاث الطبية للخيول². حاليا ، يعاني مرضى المغص بعد الجراحة من مخاطر عالية للعديد من الاضطرابات التي تهدد الحياة بما في ذلك الإنتان / صدمة التسمم الداخلي (12.3٪ من المرضى) واللفائص بعد الجراحة (13.7٪ من المرضى)³. على الرغم من التقدم المحرز في علاج مضاعفات ما بعد الجراحة، لا تزال هناك حاجة إلى علاجات متقدمة للوقاية من هذه الحالات أو علاجها.

سلطت الأبحاث ا....

Protocol

تم الحصول على الثقافات الدبقية المعوية للخيول الأولية من ثلاثة خيول قتلت رحيما إنسانيا بجرعة زائدة من الباربيتورات لأسباب لا علاقة لها بهذه الدراسة. كانت الخيول المختارة لدراسات الاستزراع عبارة عن خيول بالغة ليس لها تاريخ حالي من أمراض الجهاز الهضمي.

1. تحت المخاطية الخيول المزرعة الدبقية المعوية الأولية

1. قم بزراعة طبقات أحادية ظهارية للخيول من الخبايا الصائمة التي تم الحصول عليها من ثلاثة خيول خيول بالغة منفصلة.
   1. قم بتغطية الألواح المكونة من 24 بئرا بمحلول الطلاء لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، واغسلها مرتين بالماء المعقم ، وقم بتخزينها في ....

النتائج

يمكن أن ينتج عن التشريح الدقيق لصائم الخيول إلى الطبقة تحت المخاطية (الشكل 1) مع مزيد من الهضم الأنزيمي والميكانيكي ، مزارع خلايا قابلة للحياة من الخلايا الدبقية المعوية للخيول. أظهرت الخلايا تعدد الأشكال مع هيمنة الخلايا على شكل مغزل بما يتوافق مع الخلا?.......

Discussion

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة قابلة للتكرار للثقافة الأولية للخلايا الدبقية المعوية تحت المخاطية للخيول وإثبات تطبيقها على نمذجة التفاعلات الظهارية الدبقية في وقت المغص. أثبتت عزل الخلايا الدبقية المعوية وثقافتها ، وهي جديدة في الحصان ، أنها مفيدة في فهم مسا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution