استئصال بانيات العظم بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في يرقات الزرد النامية

Summary

يصف هذا البروتوكول نهج الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون الذي يتم إجراؤه في يرقات الزرد ، والذي يعمل كنموذج لدراسة تجديد العظام وتأثيرات الاستجابة المناعية للاستئصال.

Abstract

تتمتع أسماك الزرد (Danio rerio) بقدرة رائعة على تجديد الأعضاء والملاحق المختلفة. تمت دراسة تجديد العظام في أسماك الزرد باستخدام طرق مختلفة مثل بتر الزعانف ، ونتف القشور ، ونقب الجمجمة ، والأساليب المجهرية. باستخدام إعداد المسح بالليزر متحد البؤر المجهز بليزر ثنائي الفوتون ، تم تطوير طريقة الاستئصال بالليزر كنموذج آفة لاستئصال الخلايا المكونة للعظام (بانيات العظم) في الطبقة النامية ليرقات الزرد. تسمح الطريقة الموضحة هنا باستئصال الخلايا بطريقة دقيقة ، حيث يمكن تعديل المساحة والشكل والعمق بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة بتصوير المنطقة قبل وبعد الاستئصال مباشرة ، بحيث يمكن تحليل الآثار قصيرة المدى للإصابة. في هذا الإعداد التجريبي ، تمت دراسة الاستجابة المناعية بعد استئصال بانيات العظم في المنطقة المصابة. لوحظت زيادة في تجنيد البلاعم بعد الاستئصال ، مما يشير إلى أهمية وجودها أثناء تجديد العظام.

Introduction

تجدد أسماك الزرد أعضاء متنوعة مثل شبكية العين والدماغ والقلب والبنكرياس¹. بالإضافة إلى ذلك ، تجدد أسماك الزرد العناصر الهيكلية ، ولهذا السبب تم استخدامها لدراسة تجديد الزعانف والمقاييس والكالفاريا (أغطية الجمجمة)². تم استخدام نماذج تجريبية مختلفة لدراسة تجديد الأنسجة والعظام ، مثل استئصال الزعانف (البتر) ، وكسر الزعنفة ، ونقب الجمجمة^3،4 ، أو الإصابة بالتبريد^5،6 ، أو الاستئصال الجيني^7،8،

Protocol

حصل بروتوكول الدراسة على موافقة من Landesdirektion Sachsen ، أرقام التصاريح 25-5131 / 564/2 ، DD25-5131 / 450/4 ، 25-5131 / 496/56 ، DD25.1-5131 / 354/87. تم الحفاظ على سلالات أسماك الزرد المستخدمة وفقا للقانون الوطني وفي ظل ظروف موحدة كما هو موضح^{سابقا 27،28}. تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المواد والحلول

1. حافظ على الأجنة في وسائط 1x E3. قم بإعداد وسائط 1x E3 عن طريق تخفيف 170 مل من مخزون 60x E3 في 10 لتر من الماء منزوع الأيونات وإضافة 2 مل 0.1٪ ميثيلين بلو.<....

النتائج

تم إجراء الاستئصال بالليزر كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. اختفت إشارة GFP لبانيات العظم في المنطقة المستعصية على الفور بعد الاستئصال. لدراسة استجابة استئصال بانيات العظم من حيث الاستجابة المناعية ، تم تصوير وجود الضامة في يرقات 6 dpf قبل وعند 6 hpl. قبل الاستئصال ، لوحظ عدد ?.......

Discussion

تم تطبيق الاستئصال بالليزر في مختلف تخصصات البحث البيولوجي. على وجه الخصوص ، كان مفيدا كطريقة لدراسة تجديد الأنسجة^10،11،12. على سبيل المثال ، تم مؤخرا تحليل التوظيف وتغيرات النمط الظاهري للخلايا المناعية الفطرية بمرور ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware