JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر البروتوكول نموذجا تجريبيا جديدا في المختبر يمكنه تلخيص بيولوجيا نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة بسقالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). يتم وصف بناء هذا النموذج وإجراءات التشغيل ، من تحضير الخلايا وزراعة الخلايا إلى التحليل والتقييم.

Abstract

يتأثر زرع الجنين بالتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة في واجهة الأم والجنين. الاتصالات المباشرة وغير المباشرة بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الترس ضرورية لتنظيم تقبل بطانة الرحم. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتوسط هذا التفاعل لا تزال غير واضحة. في هذا الصدد ، هناك حاجة إلى نموذج لدراسة عملية الزرع لإنشاء نموذج شامل في المختبر يمكنه تلخيص بيولوجيا تفاعل ظهارة بطانة الرحم والسدى يتكون هذا النموذج من ألواح زراعة الخلايا العادية وسقالة مطابقة ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد (3D) من مواد منخفضة التكلفة. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من البروتوكولات لبناء النموذج ، وإعداد الخلايا ، وبذر الخلايا ، وزراعة الخلايا ، والمراقبة ، والتقييم. علاوة على ذلك ، قمنا بتضمين نتائج تمثيلية مع الخلايا التي تظهر ظروف نمو جيدة تحت المجهر. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تحاكي التفاعل بين الخلايا اللحمية بطانة الرحم والخلايا الظهارية ، وكذلك بين خلايا الأرومة الغاذية وخلايا بطانة الرحم.

Introduction

على الرغم من الأبحاث المكثفة حول الحمل البشري ، إلا أن الآليات الجزيئية في الواجهة بين الأم والجنين أثناء الزرع والحمل المبكر لا تزال غير مفهومة جيدا1. يتكون بطانة الرحم البشرية بشكل أساسي من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية بطانة الرحم (EECs) والخلايا اللحمية بطانة الرحم (ESCs). يتقدم الزرع عبر ثلاث مراحل: التثبيت ، والتعلق ، والغزو ، مما يؤدي إلى تطوير جنين كفء وبطانة الرحم المستقبلية2. بالنظر إلى القيود الأخلاقية للدراسات في الجسم الحي على البشر ، بالإضافة إلى الصعوبات في محاكاة الحالة البشرية في تماما ، أصبح بناء نماذج زراعة بطانة الرحم البشرية في المختبر وسيلة فعالة لتكرار عمليات الزرع والحمل المبكر3. هذه النماذج ذات قيمة في التحقيق في كل من حالات الحمل الطبيعية والمرضية وتوفر منصة تأسيسية للاختبار الأولي والتحقق من صحة التدخلات العلاجية في الطب الانتقالي.

تم استخدام الغرف التجارية على نطاق واسع في البحوث البيولوجية الخلوية. تقدم هذه الغرف رؤى قيمة حول هجرة الخلايا والحديث المتبادل بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك ، عادة ما تكون الغرف التجارية ذات استخدام واحد ويمكن أن تكونمكلفة 4.

تم تطوير عدد كبير من نماذج الثقافة البشرية في المختبر التي تتكون من بطانة الرحم والكيسة الأريمية ، أو بدائل الكيسة الأريمية ، لفهم عملية الزرع التفصيلية بشكل أفضل. ومع ذلك ، لا تزال هذه النماذج في مرحلتها الأولى من التطبيق نظرا لأن الهيكل ثلاثي الأبعاد عبارة عن إعداد تجريبي معقد للغاية ، وبعض وسائط التمايز المحددة باهظة الثمن5،6،7.

يتيح استخدام أجهزة الطباعة ثلاثية الأبعاد ذات الأسعار المعقولة وفترة التصنيع القصيرة نسبيا ملاءمة الهياكل لاستهداف أغراض تجريبية مختلفة. تساعد تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد على تقليل تكاليف الوقت وتمكين إنشاء هياكل معقدة ومخصصة. تعمل هذه التقنية على تسريع تصميم النموذج الأولي وتكراره بشكل كبير ، مما يجعله أداة قيمة للباحثين في مختلف المجالات ، مما يسمح لهم بإكمال عملهم بشكل أكثر كفاءة8،9،10.

هنا ، نقدم بروتوكولا تجريبيا مجديا واقتصاديا لبناء الهيكل ثلاثي الأبعاد واستخدامه كنظام لزراعة الخلايا ، والذي يمكنه محاكاة التفاعل بين الخلايا اللحمية والخلايا الظهارية في بطانة الرحم للتحقيق في تقبل بطانة الرحم أثناء زرع الجنين. يوفر هذا بديلا قابلا للتخصيص ومنخفض التكلفة للمواد التجارية التي تستخدم لمرة واحدة.

Protocol

ملاحظة: يمكن العثور على جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تم موازنة جميع الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

1. 3D الطباعة للسقالة وبناء النموذج

ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات هنا وفقا للكتاب اليدوي لآلة الطباعة المعدنية ثلاثية الأبعاد التجارية. الخطوات موصوفة بإيجاز أدناه (الملف التكميلي 1).

  1. طباعة تسوية السرير
    1. اضغط على أيقونة القائمة على لوحة القيادة وانتقل إلى الأدوات المساعدة. حدد مستوى السرير لبدء روتين التسوية.
    2. قم بإزالة ورقة الطباعة من طبقة الطباعة وحدد تم. سيرتفع سرير الطباعة إلى أقصى ارتفاع له استعدادا للتسوية. بمجرد أن يصل شريط التقدم إلى 100٪، اضغط على ابدأ.
    3. إذا لم يتم تسوية طابعة Metal X مسبقا، فحدد إعادة تعيين. إذا كان الأمر كذلك ، فاختر تخطي وانتقل مباشرة إلى الخطوة 1.1.5 (المسح الضوئي المكون من 16 نقطة).
    4. استخدم مفتاحا سداسيا مقاس 2.5 مم لتدوير جميع براغي التسوية ذات الأسرة الثلاثة في اتجاه عقارب الساعة حتى تصبح مشدودة. بعد ذلك ، قم بفكها عن طريق تدوير عكس اتجاه عقارب الساعة دورتين كاملتين لضبطها على ارتفاع منتصف النقطة. اضغط على تم للمتابعة.
    5. ستقوم الطابعة بمسح السرير ضوئيا عند 16 نقطة محددة. الامتناع عن لمس السرير أو الإطار أثناء هذه العملية. بمجرد أن يصل التقدم إلى 100٪ ، اضغط على التالي.
  2. تطبيق ورقة الطباعة
    1. قم بإزالة أي بقايا معدنية أو حطام دعم. قم بتبديل شريط تمرير الفراغ إلى تشغيل.
    2. اترك السرير ينخفض ويسخن ، ثم اضغط على التالي. ضع ورقة الطباعة فوق شبكة التفريغ واضغط على التالي.
    3. ضع مكبس الورقة فوق ورقة الطباعة، وقم بمحاذاة القضبان Z في الجزء الخلفي من الغرفة.
    4. انتظر حتى يتم تعشيق الفراغ وإنشاء ختم مستقر. بمجرد تعشيق المكنسة الكهربائية ، اضغط على تم.
  3. تحميل خيوط معدنية
    1. ضع رأس الطباعة يدويا في منتصف منطقة الطباعة. قم بإزالة غطاء رأس الطباعة عن طريق تحريكه لأعلى وبعيدا عن مسامير التثبيت.
    2. اضغط على أيقونة القائمة على لوحة الخيارات. حدد المواد من الخيارات.
    3. اختر تحميل معدني لبدء روتين التحميل. اختر التحميل السريع.
    4. حدد النوع المحدد من المواد المعدنية المراد تحميلها (على سبيل المثال ، الألومنيوم 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
    5. ضع البكرة على الحامل واضغط على التالي. أغلق الباب واترك البكرات تسخن ، ثم اضغط على التالي.
    6. أدخل المادة في المدخل الأمامي لرأس الطباعة (المسمى M) حتى يبدأ الطارد في سحبها.
  4. طباعة الأجزاء المعدنية
    1. في لوحة Printing Settings، انقر فوق Export Build. احفظ الملف على محرك أقراص USB مهيأ إلى FAT32 وأدخله في الطابعة.
    2. حدد أيقونة القائمة على اللوحة. انتقل إلى التخزين وحدد طباعة من التخزين. اختر ملف الجزء لبدء الطباعة.
  5. إزالة الجزء المعدني
    1. حرك ورقة الطباعة والأجزاء المطبوعة بعناية من سرير الطباعة. افصل الأجزاء برفق عن ورقة الطباعة. يجب أن تتقشر الورقة المرنة بسهولة.

2. التحضير للزراعة المشتركة للخلية في النموذج ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: يوصى باستخدام مواد مقاومة لدرجات الحرارة العالية كمواد استهلاكية لدعم سقالة غطاء خلية الطباعة ثلاثية الأبعاد لتسهيل تعقيم الأوتوكلاف قبل كل استخدام في تجارب زراعة الخلايا. تم استخدام الخلايا اللحمية بطانة الرحم البشرية الخالدة (HESC) والخلايا الظهارية لبطانة الرحم البشرية (إيشيكاوا) في هذه الدراسة. تم الإبلاغ سابقا عن توصيف خطوط الخلاياهذه 5,6.

  1. زراعة الخلايا والمرور
    1. تحضير 50 مل من الوسط التكميلي ل hESC عن طريق إضافة DMEM / F12 متوسط + 2 ملي لجلوتامين + 10٪ مصل بقري جنين مجريد من الفحم (FBS) + 1٪ محلول بنسلين / ستربتومايسين.
    2. قم بإعداد 50 مل من الوسط التكميلي لإيشيكاوا عن طريق إضافة Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10٪ FBS + 1٪ محلول البنسلين / الستربتومايسين.
    3. ذوبان الخلايا
      ملاحظة: تم شحن خط الخلية الذي تم شراؤه على الثلج الجاف في حالة تجميد. يجب تخزينه في مرحلة بخار النيتروجين السائل أو أقل من -130 درجة مئوية.
      1. قم بإعداد جميع المعدات المعقمة اللازمة وإنزيم التفكك ، وقم بتسخين الوسط التكميلي إلى 37 درجة مئوية.
      2. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع تأرجح لطيف من حين لآخر. انقل معلق الخلية إلى أنبوب يحتوي على 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      3. قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط الاستزراع الكامل المحضر وقم بتوزيعه في قارورتين للثقافة T25. استزراع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. تحضير الخلايا مع غطاء
    1. استخدم غطاء مربع 18 مم كسطح لثقافة الخلية ؛ تأكد من أن الغطاء نظيف ومعقم.
    2. قم بتغطية الغطاء في قاع صفيحة مكونة من 12 بئرا ب 200 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية (ECM) بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإزالة ECM من اللوحة. افحص الخلايا بحثا عن التقاء مناسب ، وتأكد من أن كثافة كلا خطي الخلايا حوالي 70٪ -80٪
    4. قم بإزالة الوسط المستهلك واغسل الخلايا ب 3 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) 2x.
    5. أضف 2 مل من إنزيم التفكك وزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصلها.
    6. قم بتحييد التركيب باستخدام وسط ثقافة كامل وإنشاء تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
    7. خذ 100 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطه مع التريبان الأزرق (عامل التخفيف = 2).
    8. حرك الغطاء فوق حجرة مقياس كثافة الدم. املأ كلا الحجرتين الجانبيتين بتعليق الخلية الذي يحتوي على التريبان الأزرق.
    9. احسب عدد الخلايا في المربعات على كلا الجانبين تحت مجهر 20x واحسب كثافة الخلايا.
    10. انقل الخلايا إلى اللوحة المحضرة بوسط طازج واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بزرع hESC في البئر عند 1 × 105 خلايا / مل لمدة 24 ساعة.
    11. بالنسبة لخط خلية إيشيكاوا ، قم بزرع الخلية في البئر بدون غطاء في اليوم التالي.

3. تجميع نموذج الثقافة المشتركة

  1. نقع السقالات مع الكحول الإيثيلي والماء المقطر المزدوج (ddw) جيدا لمدة يومين. عقم السقالات بالأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية وجففها.
  2. أضف حوالي 2 مل من الوسط التكميلي لخط خلايا إيشيكاوا إلى زراعة البئر إيشيكاوا ، مما يضمن أن مستوى السائل يغطي الغطاء.
  3. انقل غطاء الغطاء مع hESC على السقالة واحتفظ بالجانب مع الخلية لأسفل. قم بتوصيل السقالة في إيشيكاوا جيدة التزريع. بالنسبة للمجموعة الثانية ، اقلب هذا الترتيب عن طريق نقل غطاء الغطاء مع Ishikawa على السقالة وتوصيل السقالة ب hESC جيد التزريع. استخدم الخلايا بدون إعداد السقالة لتحليل نمو الخلايا المتنامي بشكل مستقل.
  4. احتضان نظام الاستزراع المشترك عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. يمكن أن تختلف فترة الاستزراع المشترك اعتمادا على التصميم التجريبي ولكنها تتراوح عادة من 24-72 ساعة.

4. الحصول على الصور

  1. قم بإزالة وسط المزرعة بعناية واشطف الخلايا برفق باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. قم بإزالة أغطية الخلايا المرفقة من أطباق الاستزراع باستخدام ملقط أو ملاقط دقيقة. اختياريا ، ضع أغطية في طبق جديد مع PBS لمنع الجفاف أثناء النقل.
  3. خذ شريحة مجهرية نظيفة وضع قطرة من PBS. انقل الخلايا المحتوية على الغطاء برفق على قطرة وسط التثبيت ، مع التأكد من أن الخلايا متجهة لأسفل على الشريحة.
  4. ضع الشريحة المعدة على مسرح المجهر المقلوب. حدد عدسة الهدف المناسبة (على سبيل المثال، 10x و20x) واضبط التركيز البؤري باستخدام مقابض التركيز البؤري الخشنة والدقيقة.
  5. قم بتعيين معلمات المجهر مثل شدة الإضاءة وإعدادات الكاميرا. باستخدام برنامج المجهر ، التقط صورا للخلايا بالتكبير المطلوب ومجالات الرؤية. اضبط وقت التعرض وإعدادات التصوير الأخرى لتحسين جودة الصورة.

5. معالجة الصور

  1. انقر فوق Open لفتح الصورة، وانقر فوق Process > Filters > Enhancement ل>اختيار المعادلة المحلية، وانقر فوق Apply.
  2. انقر فوق تحرير > تحويل إلى > مقياس رمادي 8. انقر فوق تحسين ، واختر تطبيق التباين.
  3. انقر فوق عدد وقياس الموضوعات. انقر فوق يدوي، وحدد نطاقا، واضبط الرسم البياني للتأكد من تغطية جميع الخلايا.
  4. انقر فوق Apply Mask، وأغلق النافذة الحالية، وانقر على Automatic Bright Objects > Measure، وحدد Measurement، واختر Aera وDendric وDensity وSize.
  5. انقر على "الكائنات الساطعة التلقائية"، ثم انقر على "العدد". انقر على تصدير البيانات لتصدير بيانات القياس إلى جدول بيانات.

6. حصاد الخلايا

  1. قم بإزالة أغطية الغطاء من شريحة المجهر وانقلها إلى بئر نظيف وجاف.
  2. حصاد خلية إيشيكاوا مع كاشف عزل الحمض النووي الريبي لكاشف تحلل النسخ أو ريبا للأبحاث البروتينية.
    ملاحظة: بالنسبة إلى hESC ، كانت طريقة ثقافة الغطاء أكثر فاعلية لالتقاط الصور بعد التلوين المناعي. بدلا من ذلك ، يمكن حصاد hESC باستخدام كاشف عزل الحمض النووي الريبي أو كاشف تحلل Ripa. يمكن تبادل خطوط الخلايا المزروعة على الغطاء أو سطح اللوحة ؛ ومع ذلك ، نوصي بزرع الخلايا المعدة لتحليل التصوير على الغطاء.

النتائج

يوضح الشكل 1 السقالة محلية الصنع لشرائح الخلايا المستخدمة في هذه العملية ، والتي تشتمل على حلقة دعم علوية مصممة للربط بألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 12 بئرا ، تكملها حامل منزلق خلية قاعدية يتميز بأربعة هياكل تشبه القضيب على شكل حرف L.

Discussion

يتم وصف بروتوكول مبسط وفعال من حيث التكلفة للزراعة المشتركة غير المباشرة للخلايا اللحمية والظهارية في بطانة الرحم. تستخدم هذه الطريقة سقالة محلية الصنع لشرائح الخلايا ، والتي تشتمل على حلقة دعم علوية مصممة للربط بألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 12 بئرا ، تكملها ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نريد أن نشكر جميع الموضوعات المشاركة في هذه الدراسة. كما نقدر المساعدة التصويرية من قبل Light Innovation Technology Ltd ، شنتشن. تم دعم هذه الدراسة من قبل تمويل العلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82201851) ، وبرنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. JCYJ20210324141403009 ، RCYX20210609104608036) ، صندوق بناء الانضباط الطبي الرئيسي في شنتشن (رقم المنحة. SZXK028) ، ومستشفى شنتشن باوان للنساء والأطفال (رقم المنحة. BAFY 2023003).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Hanks′ Balanced Salt solutionSolarbioH10461/10
12-well Clear TC-treated PlatesCorning3513-
25 cm² Cell Culture FlaskCorning430639-
AluminumMarkforged6061-T6-
DMEM/F12Sigma-aldrichD2906-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GibcoC11995500BT
FBSGibco10099141C1/10
Fetal bovine serumGibco10099141C
ITS PremixBiocoat3543501/100
Matrigel MatrixCorning354248ECM
Metal XMarkforgedM F-PR-5000-
Penicillin-StreptomycinGibco151401221/100
Round CoverslipBiosharpBS-18-RC-
TrypLE Select (10X)GibcoA1217701dissociation enzyme

References

  1. Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
  2. Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
  3. Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120 (2022).
  4. Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345 (2021).
  5. Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
  6. Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
  7. Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
  8. Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109 (2018).
  9. Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849 (2021).
  10. Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131 (2024).
  11. Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
  12. Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
  13. Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
  14. Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
  15. Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
  16. Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375 (2022).
  17. Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved