JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم منهجية التقييم الموجز لمستويات علامات البلعمة الذاتية LC3-II في الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن طريق النشاف المناعي. يشير تحليل مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية ، وتكوين الجسيم الذاتي ، وتكوين الأوميجاسوم إلى الدور الجديد ل STX6 في إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوسوم.

Abstract

يمثل الالتهام الذاتي (الكلي) مسارا أساسيا للتدهور الخلوي. في هذه العملية ، تبتلع الحويصلات ذات الغشاء المزدوج المعروفة باسم الجسيمات الذاتية محتويات السيتوبلازم ، ثم تندمج لاحقا مع الجسيمات الحالة للتحلل. بالإضافة إلى الدور الكنسي ، تعدل الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي أيضا مسارا إفرازيا يتضمن إطلاق الجزيئات الالتهابية وعوامل إصلاح الأنسجة والحويصلات خارج الخلية (EVs). والجدير بالذكر أن عملية نشر البروتينات المرضية بين الخلايا ، خاصة في الأمراض التنكسية العصبية التي تصيب الدماغ والحبل الشوكي ، تؤكد أهمية فهم هذه الظاهرة. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن البروتين المرتبط بالحمض النووي 43 كيلو دالتون (TDP-43) ، وهو لاعب رئيسي في التصلب الجانبي الضموري والتنكس الفصيصي الجبهي الصدغي ، يتم إطلاقه بطريقة تعتمد على الالتهام الذاتي عبر المركبات الكهربائية المخصبة بالبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة لعلامة الجسيم الذاتي 1A / 1B السلسلة الخفيفة 3B-II (LC3-II) ، خاصة عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والجسيم المحلل.

لتوضيح الآلية الكامنة وراء تكوين وإطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II ، من الضروري إنشاء طريقة يمكن الوصول إليها وقابلة للتكرار لتقييم كل من الحويصلات الإيجابية LC3-II داخل الخلايا وخارجها. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتقييم مستويات LC3-II عن طريق النشاف المناعي في الأجزاء الخلوية والأجزاء الكهربائية التي تم الحصول عليها من خلال الطرد المركزي التفاضلي. يعمل Bafilomycin A1 (Baf) ، وهو مثبط لاندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم ، كتحكم إيجابي لتعزيز مستويات الحويصلات الإيجابية LC3-II داخل الخلايا وخارجها. يستخدم جين قابلية الورم 101 (TSG101) كعلامة للأجسام متعددة الحويصلات. بتطبيق هذا البروتوكول ، ثبت أن الضربة القاضية بوساطة siRNA لسينتاكين-6 (STX6) ، وهو عامل خطر وراثي لمرض كروتزفيلد جاكوب المتقطع ، يزيد من مستويات LC3-II في جزء EV من الخلايا المعالجة ب Baf بينما لا يظهر أي تأثير كبير على مستويات TSG101. تشير هذه النتائج إلى أن STX6 قد ينظم سلبا إطلاق LC3-II خارج الخلية عبر المركبات الكهربائية ، خاصة في ظل الظروف التي يضعف فيها اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم. إلى جانب الأساليب المعمول بها لتقييم الالتهام الذاتي ، يوفر هذا البروتوكول رؤى قيمة حول دور جزيئات معينة في تكوين وإطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II.

Introduction

بروتين ربط الحمض النووي 43 (TDP-43) هو بروتين نووي نووي غير متجانس معبر عنه على نطاق واسع يشارك في تنظيم تضفير exon ، ونسخ الجينات ، واستقرار mRNA ، وكلها حيوية لبقاء الخلية1،2. في الحالات التنكسية العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) والتنكس الفصي الجبهي الصدغي (FTLD) ، يتراكم البروتين النووي TDP-43 بشكل غير طبيعي في السيتوبلازم. ينتج عن هذا التحول فقدان وظيفة TDP-43 في النواة واكتساب سام للوظيفة في السيتوبلازم. يبدأ التراكم المرضي ل TDP-43 في مناطق معينة من الدماغ والحبل الشوكي ، وينتشر عبر هذه المناطق بطريقة تشبه البريون ، وهي عملية مرتبطة ارتباطا وثيقا بتطور المرض3. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة التي ينتشر بها مرض TDP-43 عبر الدماغ والحبل الشوكي لا تزال غير معروفة.

يتم إفراز TDP-43 من خلال حويصلات خارج الخلية (EVs) ، ويتم الكشف عن مستويات مرتفعة من TDP-43 في البلازما والسائل النخاعي (CSF) لمرضى ALS و FTLD-TDP4،5،6. يحفز السائل الدماغي النخاعي من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بمرض التصلب الجانبي الضموري و FTLD الخطأ في تحديد الموقع داخل الخلايا وتجميع TDP-43 الداخلي في خلايا الورم الدبقي البشري7. وبالتالي ، فإن TDP-43 الذي يتم إطلاقه خارج الخلية عبر المركبات الكهربائية قد يتوسط في انتشار أمراض TDP-43 من خلية إلى خلية.

الالتهام الذاتي هو آلية تحلل خلوي محفوظة جيدا تتضمن إحاطة المواد غير المرغوب فيها داخل حويصلات الغشاء المزدوج ، والمعروفة باسم البلعمة الذاتية ، والتي تتميز ب LC3. تندمج هذه الجسيمات الذاتية مع البروتين الغشائي المرتبط بالليزوزومات 1 (LAMP1) الإيجابية لتكوين الجسيمات التحللية الذاتية (LC3 + / LAMP1 +) ، مما يؤدي إلى تدهور محتوياتها8. تشير التحليلات النسيجية إلى أن الجسيمات الذاتية التي تبتلع الشوائب تتراكم في الخلايا العصبية لمرضى التصلب الجانبي الضموريالمتقطع 9. ترتبط بعض الجينات المسببة لمرض التصلب الجانبي الضموري العائلي و FTLD-TDP بتنظيم الالتهام الذاتي10،11،12. تشير هذه النتائج إلى أن الالتهام الذاتي يتم قمعه في مرضى ALS و FTLD-TDP.

أشارت الدراسة السابقة إلى أن TDP-43 يفرز عبر المركبات الكهربائية الإيجابية لعلامة البلعم الذاتي LC3-II عندما يتم تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوسوم13. قد يتسبب عدم تنظيم مسار الالتهام الذاتي والليزوزوم ليس فقط في تراكم TDP-43 داخل الخلايا ولكن أيضا في إطلاق TDP-43 خارج الخلية عبر EVs14. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف كيف يتم إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II ومدى أهمية ذلك في انتشار أمراض TDP-43.

تصنف المركبات الكهربائية إلى مركبات كهربائية كبيرة (قطرها من 100 إلى 1000 نانومتر) ، والتي يتم إنتاجها من تبرعم سطح الخلية ، والمركبات الكهربائية الصغيرة (قطرها من 50 إلى 150 نانومتر) ، والتي يتم إنتاجها من تبرعم الأغشية الداخلية باتجاه الجزء الداخلي من الجسيم الداخلي (المعروف باسم الإكسوسومات) وجهاز جولجي. لجمع المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة بشكل منفصل ، نقوم بإجراء الطرد المركزي المتسلسل وجمع الكريات عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم و 110,000 × جم ، على التوالي. يتم إعداد جزء P1 EV (20,000 × جم كريات) لجمع المركبات الكهربائية الكبيرة ، ويتم إعداد جزء P2 EV (110,000 × جم من الكريات) لجمع المركبات الكهربائية الصغيرة15. منهجية تقييم مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة المشتقة من الطرد المركزي المتسلسل عن طريق النشاف المناعي مستقرة وقابلة للتكرار16. بالإضافة إلى تحليل مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية ، فإن تحليل تكوين الأوميجاسوم الذاتي وتكوين الأوميجاسوم يعزز فهم كيف يؤدي عدم تنظيم الالتهام الذاتي إلى إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II. هنا ، توضح الدراسة الحالية الدور القمعي لبناء الجملة 6 (STX6) ، وهو بروتين SNARE ، الذي يعزز حركة حويصلات النقل لاستهدافالأغشية 17 ، في إطلاق LC3-II EVs الإيجابية عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم.

Protocol

1. تحضير جزء الخلية و P1 و P2 EV من الوسط المزروع لخلايا HeLa

  1. تحضير الجزء P1 و P2 EV من الوسط المزروع لخلايا HeLa
    1. اليوم 1
      1. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا والبذور 1 × 106 خلايا على صفيحة 6 سم تحتوي على وسط مزرعة يتكون من DMEM High Glucose و 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
    2. اليوم 2 (اختياري)
      1. تحضير محلول siRNA 20 ميكرومتر.
      2. امزج 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل و 3 ميكرولتر من siRNA في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول A.
      3. امزج 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل و 5 ميكرولتر من كاشف التعدي في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول B.
      4. اخلطي المحلول أ والمحلول ب ، ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
      5. أضف خليط المحاليل A و B إلى الوسط المستخدم لزراعة خلايا HeLa. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
    3. اليوم 3
      1. اغسل الخلايا باستخدام PBS وعرضها إلى 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار محلول EDTA عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
      2. أضف 2.5 مل من وسط الاستزراع إلى الخلايا، واستخدم ماصة نقل باستور مع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر متصل لإعداد معلق أحادي الخلية.
      3. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 106 خلايا على صفيحة 10 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
        ملاحظة: من الضروري تحضير ما لا يقل عن 1 × 106 خلايا لجمع المركبات الكهربائية من وسط الاستزراع المطلوب لتحليل النشاف المناعي.
    4. يوم 4
      1. تحضير وسط الاستزراع (انظر الخطوة 1.1.1.1) الذي يحتوي إما على مركبة (DMSO) أو 100 نانومتر بافيلومايسين A1 (BAF).
      2. قم بتعريض الخلايا للوسط الذي يحتوي على مركبة أو 100 نانومتر Baf واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 24 ساعة.
    5. اليوم 5
      1. اجمع كل وسط الاستزراع من اللوحة مقاس 10 سم ، وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بطرده عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية.
        ملاحظة: سيتم استخدام الخلايا المتبقية في اللوحة مقاس 10 سم في القسم 1.2.1.
      2. لعزل جزء P1 EV ، قم بنقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 3,000 × جم إلى أنبوب الطرد المركزي ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 20,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. لعزل جزء P2 EV ، قم بنقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 20,000 × جم إلى أنبوب طرد مركزي فائق ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 110,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      4. بعد مسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمنديل مختبري ، أعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي في 50 ميكرولتر من 2x عينة عازلة [2.5٪ SDS ، 125 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) ، 30٪ جلسرين ، 10٪ 2-ميركابتو إيثانول ، 0.4٪ بروموفينول أزرق] لتحضير جزء P1 EV.
      5. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وامسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمسح مختبري ، ثم أعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الفائق في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 2x لتحضير جزء P2 EV.
      6. احتضان كسور P1 و P2 EV عند 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق.
        ملاحظة: لا تهز الأنابيب بعد الطرد المركزي عند 20,000 × جم و 110,000 × جم لتجنب التخلص من الكريات المتبقية عن طريق الخطأ. بعد إمالة الأنبوب لنقل المادة الطافية ، حافظ على موضع الأنبوب لمنع الحبيبات من الانغماس في المادة الطافية المتبقية مرة أخرى.
  2. تحضير جزء الخلية من خلايا HeLa المستنبتة
    1. اليوم 5
      1. بعد نقل وسط الاستزراع من اللوحة مقاس 10 سم إلى أنبوب سعة 15 مل ، اغسل الخلايا في طبق 10 سم باستخدام PBS وعرضها إلى 2 مل من 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار محلول EDTA عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
      2. أضف 8 مل من وسط النمو إلى الخلايا، ثم استخدم ماصة نقل باستور بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لسحب الخلايا وإعداد معلق أحادي الخلية.
      3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بطرده عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بإزالة المادة الطافية بواسطة شفاط ، وأضف PBS إلى حبيبات الخلية ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      5. قم بإزالة PBS باستخدام شفاط وصوتنة حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت A68 [10 ملي مولار Tris-HCl المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 0.8 م كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N ، N ، N-tetraacetic acid (EGTA)] يحتوي على 1٪ sarkosyl.
      6. قم بقياس تركيز البروتين في محللة الخلية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA.
      7. امزج 300 ميكرولتر من محللة الخلية مع 100 ميكرولتر من 4x عينة عازلة واحتضان الخليط عند 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق لتحضير جزء الخلية.

2. تحليل النشاف المناعي

  1. افصل كميات مكافئة من البروتينات في العينات بواسطة SDS-PAGE18.
  2. انقل البروتينات المنفصلة إلى أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF).
  3. بعد النقل ، قم بسد الأغشية بعامل الحجب لمدة 20 دقيقة.
  4. احتضان الغشاء المسدود طوال الليل مع الجسم المضاد الأولي المشار إليه في مخزن Tris المؤقت الذي يحتوي على 10٪ (v / v) مصل ربلة الساق في RT.
  5. اغسل الغشاء باستخدام مخزن ثلاثي المؤقت لمدة 5 ثوان ثم احتضنه بجسم مضاد ثانوي مترافق بالبيوتين في RT لمدة ساعتين.
  6. اغسل الغشاء باستخدام عازلة تريس لمدة 5 ثوان ثم احتضنه باستخدام محلول Tris المؤقت الذي يحتوي على محلول A بنسبة 0.4٪ (حجم / حجم) والمحلول B من المجموعة في RT لمدة 1 ساعة.
  7. اغسل الغشاء باستخدام PBS ، ثم احتضنه باستخدام PBS يحتوي على 0.04٪ (وزن / حجم) ديامينوبنزيدين ، 0.8٪ (وزن / حجم) NiCl2 · 6H2O ، و 0.3٪ (v / v) H2O2 للكشف اللوني عن النطاقات.
    ملاحظة: للكشف عن الإشارات ، طريقة التلألؤ الكيميائي مقبولة أيضا.
  8. رقمنة صورة الغشاء بواسطة ماسح ضوئي وإخضاعه لتحليل قياس الكثافة باستخدام فيجي.
    1. افتح الصورة الرقمية باستخدام فيجي ، وقم بتحويل صورة RGB الملونة إلى صورة 8 بت بالنقر فوق صورة | النوع | 8 بت.
    2. انقر فوق أداة المستطيل واضبط حجم المستطيل عن طريق سحبه لإحاطة النطاقات. حدد النطاق المراد تحليله بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | حدد الممر الأول.
    3. ضع المستطيل على النطاقات الثانية واللاحقة ، وحدد النطاقات للتحليل بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | حدد Next Lane.
    4. بعد التعرف على النطاق النهائي ، قم بقياس قياس الكثافة عبر المستطيل بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | مؤامرة الممرات.
    5. أحيط منطقة إشارة النطاق بخط مستقيم ، وانقر فوق أداة العصا ، وانقر في المنطقة لحساب شدة إشارة النطاق.

3. تحليل عدد الجسيمات الذاتية والجسيمات التحللية الذاتية

  1. اليوم 1
    1. احسب عدد خلايا HeLa باستخدام عداد الخلايا ، وبذرة 1 × 105 خلايا HeLa تعبر عن LAMP1-GFP و mCherry-LC3 على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  2. اليوم 2 (اختياري)
    1. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 1.1.2 في أطباق مقاس 3.5 سم.
  3. اليوم 3
    1. تخلص من وسط الثقافة من الأطباق مقاس 3.5 سم.
    2. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وعرضها ل 400 ميكرولتر من محلول 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار EDTA ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 1.6 مل من وسط النمو إلى الخلايا ، وقم بماصتها بماصة نقل باستور لتحضير معلق أحادي الخلية.
    4. احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بالبذور 1 × 104 خلايا على غطاء مكون من 8 غرف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يتم تحضير بئرين من الغطاء الحجري للتحكم وخلايا الضربة القاضية STX6 ، على التوالي ، بعد علاج DMSO أو Baf كما هو موضح في القسم 3.4.2.
  4. يوم 4
    1. تحضير وسط النمو بدون فينول أحمر (DMEM بدون فينول ريد ، 10٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) ، يحتوي على مركبة (DMSO) أو 100 نانومتر Baf مذاب في DMSO.
    2. استبدل وسط الاستزراع بالوسط الخالي من الفينول الأحمر ، والذي يحتوي إما على مركبة أو 100 نانومتر Baf ، واحتضانه لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: لتقييم تأثير Baf على أعداد البلعمة الذاتية والجسيمات الذاتية ، قم بإعداد الخلايا المعالجة بالمركبات كضوابط.
    3. تلطخ النوى ب 0.33 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 لمدة 30 دقيقة قبل المراقبة.
    4. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية باستخدام عدسة موضوعية 60x على مجهر ليزر متحد البؤر والتقط عشرة إطارات مختلفة.
      1. افتح صورة RGB المدمجة في فيجي ، وقسمها إلى مكونات الصورة الحمراء والخضراء والزرقاء ذات الصلة بالنقر فوق صورة | اللون | تقسيم القنوات.
      2. قم بتعيين حد ثابت للإشارتين الحمراء والخضراء في كل صورة بالنقر فوق صورة | ضبط | عتبة لكل تجربة.
      3. احسب عدد المناطق الإيجابية للإشارات الحمراء أو الخضراء بالنقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات. حدد المربع تلخيص ، ثم انقر فوق موافق. سجل القيم من العد لتحديد الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية والليزوسوم.
      4. لتراكب الصورة الخضراء على الصورة الحمراء، اضبط وضع النقل على AND بالنقر فوق تحرير | عنصر التحكم في اللصق. انسخ الصورة الخضراء ثم الصقها على الصورة الحمراء لدمجها ، مع تمييز المناطق الإيجابية لكل من الإشارات الحمراء والخضراء.
      5. لتحديد أرقام التحلل الذاتي ، احسب عدد المناطق الموجبة لكل من الإشارات الحمراء والخضراء بالنقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات. حدد المربع تلخيص ، وانقر فوق موافق، وسجل القيم في قسم العد لتحديد الحويصلات المرتبطة بجسيمات ذاتية والجسيمات الحالة
    5. اقسم العدد الإجمالي للجسيمات الذاتية والبلعمة الذاتية على العدد الإجمالي للخلايا لحساب عدد الجسيمات الذاتية والبلعمة الذاتية لكل خلية.
      ملاحظة: عد ما لا يقل عن 35 خلية في كل تجربة من التجارب الثلاث المستقلة.

4. تحليل تكوين الأوميجاسوم

  1. اليوم 1
    1. احسب عدد خلايا HeLa باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 105 خلايا على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  2. اليوم 2 (اختياري)
    1. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 1.1.2.
  3. اليوم 3
    1. قم بإعداد معلق أحادي الخلية كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.2.
    2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وبذر 1 × 105 خلايا على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  4. يوم 4
    1. امزج 1 ميكروغرام من pEGFP-C1-hAtg13 ، و 3 ميكرولتر من كاشف تعداء الحمض النووي ، و 100 ميكرولتر من وسط المصل المخفض في أنبوب احتجاز منخفض. احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة ، ثم أضفه إلى الوسط المستنبت.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  5. اليوم 5
    1. قم بتربسين الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.2.
    2. أضف 2.5 مل من وسط النمو إلى الخلايا. قم بعرض الخليط باستخدام ماصة نقل باستور لتحضير معلق أحادي الخلية.
    3. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 104 خلايا على غطاء من 8 غرف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  6. يوم 6
    1. اتبع الخطوات 3.4.1-3.4.4 لإجراء تصوير الخلايا الحية للخلايا من الخطوة 4.5.3 باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. التقط عشرة إطارات مختلفة من الصور.
      1. اتبع الخطوات 3.4.4.1-3.4.4.3 لتقسيم الصور المدمجة RGB إلى مكونات الصورة الحمراء والخضراء والزرقاء ذات الصلة، وتعيين حد ثابت للإشارات الخضراء في كل صورة، وتحديد شدة إشارة GFP. سجل القيم من قسم المساحة الإجمالية لتحديد شدة إشارة GFP-ATG13.
      2. اقسم إجمالي شدة الإشارة على عدد الخلايا التي تم فحصها لحساب شدة الإشارة لكل خلية.
        ملاحظة: عد ما لا يقل عن 34 خلية في كل تجربة من التجارب الثلاث المستقلة.

النتائج

كما هو موضح في الدراسات السابقة ، زاد علاج Baf من مستويات TSG101 (P1: P < 0.01 ، P2: P = 0.012 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR19) و LC3-II (P1: P < 0.01 ، P2: P < 0.01 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR19) في الجزء الغني بالمركبات الكهربائية. والجدير بالذكر أن ع...

Discussion

كشفت دراسة النشاف المناعي عن مستويات LC3-II و TSG101 في الجزء الخلوي ، وجزء P1 EV الغني بالمثبط الدقيق ، وجزء P2 EV الغني بالإكسوزوم. تم استخدام تصوير الخلايا الحية لفحص الجسيمات الذاتية ، والسومات المحللة الذاتية ، والأوميغا ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول ما إذا كانت ضربة قاضية STX6...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بتمويل ل Y.T. من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI [رقم المنحة 23K06837] (طوكيو ، اليابان) ومؤسسة تاكيدا للعلوم (أوساكا ، اليابان). يقدر المؤلفون الدكتور ديفيد سي روبينشتاين (معهد كامبريدج للأبحاث الطبية ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) لتزويده بخلايا HeLa.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 % Trypsin EDTAFujifilm Wako201-16945
10 cm DishThermo Fisher Scientific150464
15 mL TubeThermo Fisher Scientific339650
200 μL Pipette TipNippon GeneticsFG-301pipetting
2-MercaptoethanolNacalai Tesque21417-52a material for
sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine TetrahydrochlorideNacalai Tesque11009-41a material for DAB solution
3.5 cm Dish Thermo Fisher Scientific150460
6 cm Dish TrueLineTR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)EYELA273860
AspiratorSANSYOSAP-102inhaling solution
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG AntibodyVector Laboratories BA-10002nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG AntibodyVector Laboratories BA-20002nd antibody for immunoblotting
Blocking OneNacalai Tesque03953-95a material for immunoblotting
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61a material for
sample buffer solution
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
Centrifuge 5702 Reppendolf5703000039
Counting Slides Dual ChamberBio-Rad1450015Jcell counting
Digital Sonifier 450BRANSON
Dimethyl Sulfoxidenacalai tasque09659-14vehicle
DMEM High GlucoseNacalai Tesque08458-45culture medium
DMEM without Phenol RedNacalai Tesque08489-45culture medium
EGTADojindo 348-01311a material for A68 solution
ExcelMicrosoftversion 16.16.27satistical analysis
EZRReference No. 24version 1.68satistical analysis
FBSSigma173012Culture medium
FijiNIHImage analysis tool
GlycerolNacalai Tesque09886-05a material for
sample buffer solution
Hoehst33342Dojindo H342
Hydrogen PeroxideFujifilm Wako080-0186a material for DAB solution
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011cleaning wipe
Low Retention TubeNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser MicroscopeCarl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 AntibodyMBLM186-31st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride HexahydrateFujifilm Wako149-01041a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium SaltNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicillin/StreptomycinNacalai Tesque26253-84Culture medium
Pierce BCA Protein Assay KitsThermo Fisher Scientific23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA AntibodyBioAcademia70-0801st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 AntibodyProteinTech10841-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 AntibodyProteinTech28283-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 AntibodyProteinTech20986-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride MembraneMillioreIPVH00010a material for immunoblotting
RR development core teamversion 4.4.1satistical analysis
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA transfection reagent
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA for transfection
Sodium ChlorideNacalai Tesque31320-05a material for Tris
buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl SulfateFujifilm Wako192-13981a material for
sample buffer solution
SPARK Microplate ReaderTECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300siRNA transfection
SucroseFujifilm Wako193-00025a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal PrinterBio-Rad1450109J1cell counting
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100incubation
TransIT-293Mirus BioMIR 2700DNA transfection reagent
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneNacalai Tesque35406-75a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%Bio-Rad1450021cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm Beckman Coulter361706collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Coulter344059collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000immunoblotting
Wash BottleAs One1-4640-02washing membrane
μ-Slide 8 Well Highibidi80806

References

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16 (2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78 (2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272 (2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705 (2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550 (2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

212 LC3 II STX6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved