JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة للمراقبة الكمية في الوقت الفعلي لتركيزات أيون الكالسيوم (Ca2+) في الخلايا باستخدام تصوير Ca2+ أحادي الخلية باستخدام صبغة Fura-2 / AM. تتيح هذه التقنية تحميل الصبغة بكفاءة والحساب الدقيق لمستويات Ca2+ من خلال نسب شدة التألق ، مما يجعلها نهجا بسيطا وسريعا لتطبيقات البحث.

Abstract

يعد تصوير الخلية المفردة Ca2+ ضروريا لدراسة قنوات Ca2+ التي يتم تنشيطها بواسطة محفزات مختلفة مثل درجة الحرارة والجهد والمركب الأصلي والمواد الكيميائية وما إلى ذلك. يعتمد بشكل أساسي على تقنية التصوير المجهري ومؤشر Ca2 + ذي الصلة Fura-2 / AM (AM هو اختصار ل Acetoxymethyl ester). داخل الخلايا ، يتم تحلل Fura-2 / AM بواسطة الإستراز إلى Fura-2 ، والذي يمكن أن يرتبط بشكل عكسي بالسيتوبلازمي الحر Ca2+. يتحول الحد الأقصى للطول الموجي للإثارة من 380 نانومتر إلى 340 نانومتر (عند التشبع ب Ca2+) عند الربط. ترتبط شدة التألق المنبعثة كميا بتركيز Ca2+ المرتبط. من خلال قياس نسبة 340/380 ، يمكن تحديد تركيز Ca2+ في السيتوبلازم ، مما يلغي الأخطاء الناتجة عن الاختلافات في كفاءة تحميل مسبار الفلورسنت بين العينات المختلفة. تسمح هذه التقنية بالمراقبة في الوقت الفعلي والكمي والمتزامن لتغيرات Ca2+ في خلايا متعددة. يتم تخزين النتائج في ". XLSX" للتحليل اللاحق ، وهو سريع ويولد منحنيات تغيير بديهية ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة الكشف. من وجهات نظر تجريبية مختلفة ، تسرد هذه المقالة استخدام هذه التقنية للكشف عن إشارات Ca2+ في الخلايا ذات البروتينات القناة الداخلية أو المعبر عنها بشكل مفرط. في غضون ذلك ، تم أيضا عرض طرق مختلفة لتنشيط الخلايا ومقارنتها. الهدف هو تزويد القراء بفهم أوضح لاستخدام وتطبيقات التصوير أحادي الخلية Ca2+ .

Introduction

يلعب Ca2+ دورا مهما في نقل الإشارات الخلوية ، حيث ينظم الوظائف الخلوية المختلفة مثل تقلص العضلات1 ، والتوصيل العصبي2 ، والإفراز3 ، والتعبير الجيني4 ، وبالتالي التأثير على العمليات الفسيولوجية المتعددة. يمكن أن تؤدي تركيزات Ca2+ غير الطبيعية إلى أمراض مثل عدم انتظام ضرباتالقلب 5 واضطرابات التخثر6 والاختلالات الهرمونية7. لذلك ، فإن دراسة آليات تغيرات تركيز Ca2+ داخل الخلايا لها أهمية قصوى.

تشارك القنوات الأيونية المختلفة في تنظيم تركيز Ca2+ في الخلايا ، بما في ذلك قنوات الكالسيوم المنشط بإطلاق الكالسيوم (CRAC) الانتقائية عالية الكالسيوم2 + 8 والقنوات الكاتيونية غير الانتقائية من عائلة TRP9. يمكن تنشيط هذه القنوات الأيونية عن طريق المحفزات مثل درجة الحرارة10 والمركبات والمكونات النشطة الموجودة في الطب الصيني التقليدي11 ، مما يلعب دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية المتعلقة ب Ca2+.

تعد المراقبة الفعالة لتغيرات تركيز Ca2+ داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة القنوات الأيونية المرتبطة ب Ca2+ ، لا سيما في مجال الطب الصيني التقليدي ، حيث يلعب تنظيم إشارات الكالسيوم دورا مركزيا في العديد من الأساليب العلاجية. حاليا ، يمكن تصنيف الطرق الأساسية لقياس Ca2+ داخل الخلايا إلى نوعين: القياسات الكهربائية والبصرية. يستخدم نهج القياس الكهربائي تقنية مشبك التصحيح لتقييم التغيرات في إمكانات غشاء الخلية بسبب تدفق Ca2+ 12.

في القياس البصري ، ترتبط مجسات الفلورسنت على وجه التحديد بCa 2+ ، مما يسمح للباحثين بتتبع التغيرات في شدة التألق الخلوي. تشمل الطرق البصرية الشائعة التقنيات القائمة على البروتين الفلوري والصبغة الفلورية. في الطرق القائمة على البروتين الفلوري ، يمكن للباحثين الإفراط في التعبير عن البروتينات الفلورية الحساسة ل Ca2 + مثل Cameleon13 و GCaMP14 في الخلايا ومراقبة تغيرات إشارة التألق باستخدام المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي لمراقبة التحولات في تركيزات Ca2 + السيتوبلازمية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين الإفراط في التعبير عن هذه البروتينات في الفئران واستخدام الفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون للمراقبة في الوقت الفعلي في الجسم الحي أو على مستوى الأنسجة لتركيزات Ca2+ داخل الخلايا ، مما يوفر دقة عالية واختراق الأنسجة العميقة10.

بالنسبة للطرق القائمة على صبغة الفلورسنت ، تشمل مجسات Ca2+ شائعة الاستخدام Fluo-3 / AM و Fluo-4 / AM و Fura-2 / AM10. يحتضن الباحثون الخلايا في محلول يحتوي على مجسات الفلورسنت هذه ، والتي تعبر غشاء الخلية ويتم شقها بواسطة استيرازات داخل الخلايا لتشكيل مركبات نشطة (على سبيل المثال ، Fluo-3 و Fluo-4 و Fura-2) التي تبقى داخل الخلية. تظهر هذه المجسات الحد الأدنى من التألق في شكلها الحر ولكنها تنبعث منها مضان قوي عند ربطها ب Ca2+ داخل الخلايا ، مما يشير إلى التغيرات في تركيزات Ca2+ السيتوبلازمية. بالمقارنة مع البروتينات والأصباغ الفلورية الأخرى ، عادة ما يكون Fura-2 متحمسا عند أطوال موجية 340 نانومتر و 380 نانومتر. عندما يرتبط ب Ca2+ الحر داخل الخلايا ، يخضع Fura-2 لتحول امتصاص ، مما يحرك ذروة الطول الموجي للإثارة من 380 نانومتر إلى 340 نانومتر ، بينما تظل ذروة الانبعاث بالقرب من 510 نانومتر دون تغيير. هناك علاقة كمية بين شدة التألق وتركيز Ca2+ المرتبط ، مما يسمح بحساب تركيز Ca2+ داخل الخلايا عن طريق قياس نسبة شدة التألق عند هذين الطولين الموجيين للإثارة. تقلل قياسات النسبة من آثار التبييض الضوئي ، وتسرب مسبار الفلورسنت ، والتحميل غير المتكافئ ، والاختلافات في سمك الخلية ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية وقابلية للتكرار (الشكل 1).

تستخدم أنظمة التصوير أحادية الخلية Ca2+ بشكل أساسي تقنيات الفحص المجهري ومؤشر Ca2 + Fura-2 / AM للكشف عن تركيزات Ca2+ داخل الخلايا. تشتمل هذه الأنظمة على مجهر مضان ، ومصدر ضوء تصوير Ca2+ ، وبرنامج تصوير مضان ، مما يتيح المراقبة الكمية في الوقت الفعلي لتغيرات Ca2+ في السيتوبلازم لخلايا متعددة في وقت واحد (ما يصل إلى 50 خلية لكل مجال رؤية). يتم حفظ النتائج بتنسيق ".xlsx" لتحليلها لاحقا. يوفر النظام سرعة تحليل سريعة (حوالي دقيقة واحدة لتحليل مجموعة من الخلايا داخل مجال رؤية واحد) ويولد منحنيات تغيير بديهية ، مما يعزز بشكل كبير من كفاءة الكشف. يعد التصوير أحادي الخلية Ca2 + نهجا تقنيا أساسيا لدراسة القنوات المتعلقة ب Ca2 + وله قيمة كبيرة في البحوث الطبية الحيوية المتعلقة بالقناة الأيونية. من المتوقع أن يؤدي تطبيقه في تقنية تصوير الكالسيوم أحادي الخلية إلى تعزيز البحث بشكل كبير حول الآليات الكامنة وراء الطب الصيني التقليدي.

Protocol

تمت الموافقة على الطرق التجريبية واتبعتها إرشادات IACUC لجامعة تسينغهوا وجامعة بكين للطب الصيني. يقدم هذا البروتوكول طرق تصوير Ca2+ أحادية الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة من جلد العديد من الفئران حديثي الولادة (في غضون ثلاثة أيام من الولادة ، مع رفقاء القمامة العشوائية حسب الجنس ، الفئران C57BL / 6). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلية

ملاحظه: الخلايا الأولية ، أو خطوط الخلايا ذات الجينات المستهدفة الداخلية ، أو تلك التي تم نقلها ببلازميدات مفرطة التعبير عنها كلها مناسبة لتصوير Ca2+ أحادي الخلية. تم الحصول على البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة من مختبر البروفيسور شياو بايلونغ في جامعة تسينغهوا. تم إنشاء هذه البلازميدات من خلال دمج تسلسلات من بروتين الفلورسنت GFP مع STIM1 البشري ، وبروتين الفلورسنت DsRed مع Orai1 البشري ، وبروتين الفلورسنت mRuby مع الأرانب TRPV1 ، بالإضافة إلى البروتين الفلوري الأحمر mCherry في ناقلات البلازميد العاثية10.

  1. قم بإعداد شرائح زجاجية معقمة بقطر 8 مم في صفيحة 24 بئرا. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت بولي دي ليسين (PDL) (50 ميكروغرام / مل في DPBS) إلى كل بئر.
  2. احتضن الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالطلاء ، ثم تخلص من محلول الطلاء باستخدام ماصة.
  3. اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام DPBS واتركها جانبا لاستخدامها لاحقا.
  4. زراعة الخلايا الأولية وخطوط الخلايا بشكل منفصل وفقا لطرق زراعتها المحددة10.
  5. خلايا البذور على صفيحة 24 بئرا محضرة بكثافة حوالي 1.5 × 105 خلايا لكل بئر. استخدم الخلايا لتصوير Ca2+ بمجرد التصاق بغطاء الغطاء.
  6. بالنسبة للخلايا التي تفرط في التعبير عن البلازميدات ، قم بنقل10،15 البلازميد المستهدف (1 ميكروغرام / بئر) باستخدام كاشف التعداء Lipofectamine 2000 (أو Lipofectamine 3000) بنسبة 1: 1 ، واحتضانه في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبا.
    ملاحظه: قد يكون وقت الحضانة أطول ضروريا للبروتينات المعبر عنها الأكبر.

2. إعداد حل عمل Fura-2 / AM

  1. أضف 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من مسحوق Fura-2 / AM واخلطه جيدا لتحضير محلول مخزون 1 ميكروغرام / ميكرولتر من Fura-2 / AM.
  2. امزج محلول مخزون Fura-2 / AM و Pluronic F-127 في مخزن هانك الذي يحتوي على 1.3 ملي مولار من الكالسيوم2+.
    ملاحظه: التركيز النهائي ل Fura-2 / AM و Pluronic F-127 في محلول العمل هو 2.5 ميكروغرام / مل. يتم تحضير المخزن المؤقت ل Hank عن طريق إضافة 10 ملي مولار HEPES إلى 1x مخزن مؤقت HBSS.
  3. استخدم رقائق الألومنيوم لحماية حل العمل Fura-2 / AM من الضوء.

3. المعالجة المسبقة للخلية لتصوير Ca2+ أحادي الخلية

  1. انقل الشرائح الزجاجية مع الخلايا إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على عازلة هانك للغسيل.
  2. تخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل Fura-2 / AM إلى كل بئر.
  3. احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح بتحميل المسبار.
  4. قم بإزالة المخزن المؤقت للعمل Fura-2 / AM واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مخزن هانك للتخلص من Fura-2 / AM الزائد. الخلايا جاهزة الآن للاستخدام.

4. بدء تشغيل نظام التصوير Ca2+

ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام المجهر الفلوري لتصوير Ca2+ .

  1. ابدأ المكونات التالية بالتسلسل: ضوء DG4 (مصباح الزينون) ، والكاميرا ، ومصدر الضوء الأبيض ، ووحدة التحكم في مرحلة المجهر ، والمجهر ، والكمبيوتر ، وبرنامج التصوير الفلوري.
    ملاحظه: في حالة اكتشاف تنشيط القنوات الأيونية حسب درجة الحرارة ، قم أيضا بتشغيل المكونات التالية: نظام التروية ، ونظام التدفئة ، وجهاز التحكم في درجة الحرارة ، وجهاز تسخين / تبريد دوران السائل.

5. إجراء الاستجابة الخلوية Ca2+

  1. افتح برنامج التصوير الفلوري (انظر جدول المواد).
    1. اختر البروتوكول، ثم حدد ملف، متبوعا ببروتوكول التحميل. حدد البروتوكول وانقر فوق موافق.
    2. قم بتكوين التجربة (في قائمة القائمة).
    3. حدد تجربة جديدة.
  2. قم بتركيب غرفة التروية على المجهر.
    ملاحظه: قم دائما بخفض الهدف بالكامل عند تركيب الغرف أو إزالتها باستخدام مقبض التركيز الخشن لمنع تلف الهدف.
  3. قم بإزالة شرائح الخلية المعالجة Fura-2 / AM وضعها في الغرفة التي تحتوي على مخزن هانك.
  4. ابدأ نظام التروية.
  5. حدد هدف DIC 20x واضبط التركيز البؤري تحت الضوء الأبيض.
  6. انقر فوق Cfg Exp على شريط المهام.
    1. حدد الفلور المطلوب للتصوير.
    2. تحديد تردد الاستحواذ وإعدادات العرض على الشاشة (اكتساب: تحقق من 340 ، 380 ، GFP ؛ الفاصل الزمني للاكتساب: 1 ثانية ؛ الفاصل الزمني للحفظ: 1 ثانية).
  7. ركز
    1. في لوحة تحكم التجربة ، انقر فوق الزر تركيز .
    2. اضبط وقت الاستحواذ (عادة 100 مللي ثانية) واربحه حسب الحاجة ، ثم "وفر لهذه الموجة".
      ملاحظه: بالنسبة للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم الكسب بدلا من وقت التعرض.
    3. اختر الطول الموجي المطلوب للتركيز (على سبيل المثال ، 380) وانقر فوق بدء التركيز.
    4. قم بتبديل العرض من المناظير إلى الكمبيوتر.
    5. تأكد من ظهور لون أخضر باهت من خلال المنظار.
    6. ركز على الخلايا ، باستخدام التركيز التقريبي أولا لإغلاق الهدف ، ثم التركيز الدقيق.
      ملاحظه: سوف يصدر المجهر صوتا إذا اقترب كثيرا من المسرح. إذا حدث هذا ، فقم بخفض الهدف ، وأعد تنظيم اللوحة على المسرح ، وركز مرة أخرى. قلل الوقت المستغرق في التركيز لتقليل تلف الخلايا الناجم عن الليزر.
    7. تحقق من شدة تألق الخلايا أثناء عملية التركيز.
    8. اضبط شدة التألق للخلايا عن طريق تعديل وقت التعرض والكسب.
      ملاحظه: يجب أن يكون وقت التعرض والكسب ل 340 و 380 متسقين.
    9. بمجرد تحقيق التركيز الجيد ، اضغط على الزر الموجود على المجهر لتبديل العرض إلى الكمبيوتر.
    10. أعد التركيز حسب الحاجة للحصول على الصورة الأكثر وضوحا على الكمبيوتر ، ثم انقر فوق إيقاف التركيز.
  8. إجراء بديل للعثور على الخلايا الإيجابية ل GFP
    1. استخدم الإجراء 340/380 أولا لتحقيق تركيز جيد على الخلايا.
    2. حدد FITC ثم انقر فوق بدء التركيز.
    3. استخدم وحدة التحكم في المرحلة للعثور على الخلايا موجبة GFP.
    4. قم بتبديل العرض إلى الكمبيوتر ثم انقر فوق إيقاف التركيز.
  9. اختيار المنطقة
    1. انقر فوق الزر "المنطقة " في شريط القائمة.
    2. حدد نوع الإضاءة المفضل (340/380/FITC/TRITC). يتم اختيار مرشحات FITC و TRITC ل GFP و mCherry / DsRed / mRuby ، على التوالي ، للخلايا التي تفرط في التعبير عن البلازميدات المستهدفة. وإلا، فحدد Fura-2.
      ملاحظه: تجنب اختيار الخلايا التي تكون في حالة سيئة أو ميتة ، مثل تلك التي من الواضح أنها مستديرة أو ذات بروتينات الفلورسنت المعرضة بشكل مفرط.
    3. انقر فوق الحصول على الصور ، ثم موافق.
    4. ستظهر نافذة جديدة. حدد الخلايا بالنقر فوق الأداة البيضاوية ثم النقر فوق الخلية.
    5. حدد الخلايا المرغوبة تحت التألق الذي يحمله البروتين المستهدف (FITC أو TRITC). حدد خلايا التحكم التي لا تعبر عن البروتين المستهدف في حالة 380 نانومتر.
    6. التراجع عن منطقة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الدائرة ثم تحديد حذف المنطقة.
    7. حدد عينة خلفية كمنطقة أخيرة وسجل رقم المعرف الخاص بها.
    8. انقر فوق حفظ ثم تم.
  10. طرح الخلفية
    1. انقر فوق زر القائمة المراجع.
    2. حدد رقم منطقة الخلفية.
      ملاحظه: إذا كانت الخلفية هي آخر منطقة تم تحديدها ، فسيؤدي إدخال رقم مرتفع جدا إلى التبديل تلقائيا إلى آخر منطقة تم اختيارها.
    3. حدد المربع طرح المراجع ثم انقر فوق موافق.
  11. بيانات السجل
    1. انقر فوق الزر Log Data في لوحة تحكم التجربة.
      ملاحظه: يتم حفظ الصور فقط إذا كانت هناك رغبة في إعادة تشغيل التجربة لاحقا. عادة ، يكفي مجرد تحديد مربع البيانات.
    2. تأكد من ظهور مطالبة تطلب نوع ملف البيانات المفضل ؛ تحديد. يوصى بتنسيق XLSX .
    3. سيتم فتح ورقة عمل من النوع ".xlsx". سيؤدي تصغير ورقة العمل إلى منعها من شغل مساحة الشاشة.
  12. الحصول على البيانات
    1. في قسم الفاصل الزمني في لوحة التحكم، اضبط الفاصل الزمني للحصول على البيانات إلى 1 ثانية.
      ملاحظه: يمكن تعديل هذا وفقا للاحتياجات الفعلية.
    2. انقر فوق Zero Clock and Acquire في لوحة تحكم التجربة لبدء التجربة. ستكون خطوط الأساس مرئية على رسم بياني يشير إلى كل منطقة من مناطق الخلية المحددة.
    3. إجراء سلسلة من العلاجات على الخلايا وفقا للمتطلبات التجريبية.
    4. لمراقبة استجابة درجة حرارة الخلايا ، قم بتسخين المخزن المؤقت في نظام التروية إلى درجة حرارة مناسبة باستخدام جهاز التحكم في درجة الحرارة.
    5. لمراقبة آثار الأدوية على الخلايا ، قم ببث أو إضافة مخزن مؤقت يحتوي على دواء يدويا وتسجيل تغيرات الخلايا.
    6. بعد اكتمال الحصول على البيانات ، انقر فوق إيقاف مؤقت.
      ملاحظه: يمكن إيقاف الحصول على البيانات مؤقتا، ويمكن إعادة ضبط الساعة في أي وقت أثناء التجربة.
    7. حفظ البيانات وتحليلها.
  13. انقر فوق ملف وإغلاق التجربة لإنهاء التجربة ، وحدد لا في مربع الحوار لحفظ البروتوكول.
  14. افتح تجربة جديدة بالنقر فوق جديد في القائمة ، وكرر العملية.
  15. إيقاف التشغيل
    1. أغلق البرنامج وانقل البيانات من الكمبيوتر.
    2. عكس إجراء بدء التشغيل.
    3. سجل الساعات في ورقة التسجيل ونظف أي فوضى.
  16. تحليل البيانات
    1. قم بتمثيل تركيز Ca2+ داخل الخلايا بنسبة Fura-2 340/380 أو قم بالتحويل إلى تركيز Ca2+ المقابل.

النتائج

كشف استجابة درجة الحرارة
الخلايا الكيراتينية الأولية
تم عزل الخلايا الكيراتينية الأولية من الفئران حديثي الولادة وأعدت وفقا للبروتوكولات المعمولبها 10. تم زرع هذه الخلايا في 24 بئرا تحتوي على شرائح زجاجية. بعد تحميل مسبار Fura-2 ، تم ضبط الترك...

Discussion

يعد تطبيق أنظمة التصوير أحادية الخلية Ca2+ واسع النطاق ، مما يتيح دراسة إشارات Ca2+ في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية ، والخلايا الجذعية16 ، وخلايا الكبد ، وخلايا القلب17 ، والخلاياالبودوية 18 ، والخ?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم تقديم الشكر والتقدير إلى Bailong Xiao من جامعة Tsinghua لمشاركة نظام التصوير أحادي الخلية Ca2+ ونظام التشغيل للتحكم في درجة الحرارة ، وكذلك على الدعم والمساعدة في هذا المشروع. تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000705) ، وبرنامج رعاية النخبة الطلابية الشباب من قبل الجمعية الصينية للطب الصيني (CACM-(2021-QNRC2-B11)) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2020-JYB-XJSJJ-026) ، (2024-JYB-KYPT-06).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CameraNikon
CapsaicineSigma211275
CL-100 temperature controllerWarner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)SigmaC1530
DG-4 lightSutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Amresco231
DPBSThermofisher14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software) Molecular Devices
Fluorescence microscopeNikon
Fura-2/AMInvitrogenF1201
HBSS bufferGibco14175103
HEPES SigmaH3375
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
Pluronic F-127 BeyotimeST501
poly-D-lysine BeyotimeST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device Harvard Apparatus
White-light sourceNikon

References

  1. Murthy, K. S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).
  2. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  3. Rogers, D. F. Physiology of airway mucus secretion and pathophysiology of hypersecretion. Respir Care. 52 (9), 1134-1146 (2007).
  4. Mitra, R., Hasan, G. Store-operated Ca(2+) entry regulates neuronal gene expression and function. Curr Opin Neurobiol. 73, 2022 (2022).
  5. Landstrom, A. P., Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. Calcium signaling and cardiac arrhythmias. Circ Res. 120 (12), 1969-1993 (2017).
  6. Zheng, C., Zhang, B. Combined deficiency of coagulation factors v and viii: An update. Semin Thromb Hemost. 39 (6), 613-620 (2013).
  7. Ahmadian Elmi, M., Motamed, N., Picard, D. Proteomic analyses of the g protein-coupled estrogen receptor gper1 reveal constitutive links to endoplasmic reticulum, glycosylation, trafficking, and calcium signaling. Cells. 12 (21), 2571 (2023).
  8. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the crac channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  9. Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: A heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  10. Liu, X., et al. Stim1 thermosensitivity defines the optimal preference temperature for warm sensation in mice. Cell Res. 29 (2), 95-109 (2019).
  11. Bharate, S. S., Bharate, S. B. Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds. ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).
  12. Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483 (7388), 176-181 (2012).
  13. Behera, S., et al. Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots. New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).
  14. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  15. Liu, X., et al. Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation. Cells. 12 (22), 2613 (2023).
  16. Wang, S., et al. ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells. Cell Discov. 4, 2 (2018).
  17. Jiang, F., et al. The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction. Nat Commun. 12 (1), 869 (2021).
  18. Tao, Y., et al. Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury. J Biol Chem. 298 (6), 101990 (2022).
  19. Guo, L., et al. Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies. Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).
  20. Gouin, O., et al. Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization. Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).
  21. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am. J Vis Exp. (23), e1067 (2009).
  22. Wang, Y., et al. A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel. Nat Commun. 9 (1), 1300 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 214 sigle Fura 2 340 380

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved