JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة لرسو الجزيئات جنبا إلى جنب مع تقنيات المسبار للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة للطب الصيني التقليدي وأهداف البروتين.

Abstract

تلعب إنزيمات إزالة الهوبيكوينتين (DUBs) دورا محوريا في تعديل التوازن في كل مكان ، حيث يكون UCHL3 نموذجا أصليا للسيستين DUB يشارك بشكل معقد في عدد لا يحصى من العمليات الفسيولوجية والمرضية. لذلك ، فإن تطوير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3 (UCHL3) له أهمية كبيرة. يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء عملية للفحص الافتراضي والتحقق من صحة مثبطات الجزيئات الصغيرة للسيستين DUB التي يمثلها UCHL3. أولا ، يتم فحص المثبطات المحتملة ل UCHL3 فعليا باستخدام تقنية الإرساء الجزيئي ، ويتم تصور التفاعل بين الأدوية وأهداف البروتين. بعد ذلك ، يتم التحقق من فعالية الدواء الذي تم فحصه ، Danshensu ، من خلال فحوصات تثبيط النشاط في المختبر . يتم استخدام Ubiquitin-7-amino-4-methylcoumarin (Ub-AMC) والهيماجلوتينين-يوبيكويتين-فينيل سلفون (HA-Ub-VS) كمجسات لاختبار النشاط في المختبر ، حيث يمكن أن ترتبط بشكل تنافسي ب DUB مع مثبطات جزيئات صغيرة لتقييم نشاط UCHL3. تشير النتائج إلى أن Danshensu لديه تقارب ربط جيد مع UCHL3 في الإرساء الجزيئي ، ويمكنه تثبيط نشاط UCHL3 بشكل تنافسي مع HA-Ub-VS. توفر هذه النتائج مراجع مهمة لمزيد من البحث والتطوير للأدوية العلاجية التي تستهدف UCHL3.

Introduction

Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة للبروتينات ، وهي عملية تقوم من خلالها E1 بربط الإنزيمات المنشطة لليوبيكويتين ، والإنزيمات المترافقة مع اليوبيكويتين E2 ، و E3 ubiquitin ligases ubiquitin بالبروتين المستهدف ، ويمكن عكس عملية الانتشار في كل مكان بأكملها عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs) 1،2،3،4. نظرا لدورها الفسيولوجي والمرضي المهم ، تعتبر DUBs أهدافا مهمة لاكتشاف الأدوية5،6.

تم تحديد أكثر من 100 DUBs في البشر 7,8. تعمل عادة كإيزوببتيداز مسؤول عن شق رابطة الأيزوببتيد بين الطرف C من اليوبيكويتين وبقايا اللايسين في الركيزة أو جزيء يوبيكويتينآخر 9،10. حاليا ، يتم تصنيفها بشكل أساسي إلى سبع عائلات رئيسية ، وهي: الببتيداز الخاصة باليوبيكويتين (USPs) ، وبروتياز ورم المبيض (OTUs) ، و Jab1 / Mov34 / Mpr1 Pad 1 N-terminal + بروتياز المجال (JAMMs) ، والفكرة التي تتفاعل مع بروتياز عائلة DUB الجديدة المحتوية على اليوبيكويتين (MINDYs) ، وهيدروكسيلاز يوبيكويتين C-terminal (UCHs) ، وبروتياز مجال Machado-Josephin (MJDs) ، وببتيداز يوبيكويتين المحتوي على إصبع الزنك 1 (ZUP1) 9. بالإضافة إلى JAMMs ، التي تنتمي إلى عائلة ميتالوبروتياز الزنك11 ، فإن DUBs الأخرى هي بروتياز السيستين الذي يتميز بثالوث حفاز يتكون من السيستين التحفيزي والهيستيدين وبقايا حمضية ثالثة12،13. تفتح هذه الخصوصية طرقا لتطوير مثبطات جزيئات صغيرة تستهدف الموقع النشط للإنزيم أو الجيوب الخيفية القريبة.

في مجال أبحاث إنزيم deubiquitinating ، هناك تحد كبير في توصيف نشاطهم14،15. يعمل التوصيف القائم على المجسات النشطة كنهج حاسم لدراسة مثبطات DUB16. من خلال إجراء فحوصات تنافسية مع المجسات والمثبطات القائمة على النشاط في محللات الخلايا أو البروتينات المؤتلفة ، يمكن توصيف نشاط DUBs ، مما يسهل تطوير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف هذه الإنزيمات. Ub-AMC هو مسبار مبكر يستخدم للكشف عن نشاط DUB ، والذي يحتوي على مجموعة فلورية متصلة بالطرف C من ubiquitin17،18. عندما تمارس DUBs نشاطها التحفيزي ، يتم إطلاق AMC بكميات كبيرة ، ويتم تعزيز شدة الفلورسنت للضوء المكتشف وفقا لذلك. تم استخدام هذا المسبار على نطاق واسع في الفحص عالي الإنتاجية لمثبطات DUB19،20. يستخدم مسبار HA-Ub-VS أيضا لقياس نشاط DUB21. لديها مجموعة من الفينيل سلفون في محطة C في ubiquitin ، مما يجعلها ركيزة انتحارية ل DUBs. بعد فصل الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم وبولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ، يمكن الكشف عن DUBs النشطة باستخدام النشاف الغربي22،23،24.

يستخدم الطب الصيني التقليدي (TCM) النباتات الطبية لأكثر من 2000 عام. يعد تطوير أدوية جديدة من المنتجات الطبيعية ذا أهمية طبية كبيرة ، مع التركيز بشكل أساسي على تحديد المكونات النشطة وتوضيح آلياتها25. سالفيا ميلتيوريزا Bge هو عشب يستخدم على نطاق واسع في علاج مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك السرطان والقلب والأوعية الدموية والكبد والعصبية26. حاليا ، يحتوي على جزيئات صغيرة معروفة مثل tanshinone27 و Danshensu28 وحمض tanshinic29 وما إلى ذلك. تظهر هذه المركبات أنشطة بيولوجية متنوعة مثل التأثيرات المضادة للتخثر ومضادات الأكسدة والمضادة للأورام ، مما يجعلها ذات قيمة عالية للبحث26. حددت الدراسات الحديثة Danshensu كمثبط تساهمي للبروتياز الشبيه بالكيموتريبسين 3 (3CLpro) ل SARS-CoV-230. لقد ثبت أنه يشكل رابطة تساهمية مع بقايا الموقع النشط C145 من 3CLpro ، مما يشير إلى وجود مثبطات البروتياز الجزيئية الصغيرة المحتملة في Salvia miltiorrhiza Bge.

ينتمي Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3 (UCHL3) إلى بروتياز السيستين داخل عائلة DUBs من UCH. يعتمد على المخلفات المحفوظة مثل السيستين 95 ، الهيستيدين 169 ، وحمض الأسبارتيك 184 لتحفيز وظائفه بشكل فعال31،32. يلعب أدوارا حاسمة في المسارات الجزيئية المتعددة ، بما في ذلك دورة الخلية ، وإعادة التركيب المتماثل ، وإصلاح فواصل الحمض النووي المرتبطبالبروتين 33. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنظيمه في العديد من أنواع السرطان مثل سرطان المبيض والبروستاتا والبنكرياس والقولون والمستقيم وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة34. بناء على هذه الدراسات ، يبدو أن UCHL3 هدف واعد لعلاج الأمراض. تم تحديد العديد من مثبطات الجزيئات الصغيرة ل UCHL3 وهي تتقدم نحو الاستخدام السريري35،36.

في هذه الدراسة ، تم إجراء الإرساء الجزيئي للتحقيق في التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة من Salvia miltiorrhiza Bge و UCHL3. بعد ذلك ، حددت تجربة في المختبر باستخدام مجسات Ub-AMC و HA-Ub-VS الخاصة ب DUB Danshensu كمثبط جزيئي صغير ل UCHL3. تنبأ الالتحام الجزيئي أيضا بمواقع الارتباط المحتملة ل Danshensu ، مما يشير إلى آلية عملها.

Protocol

1. تنزيل هياكل الجزيئات الصغيرة من Salvia miltiorrhiza Bge و UCHL3

  1. قم بتنزيل ملف الجزيء الصغير.
    1. افتح قاعدة بيانات TCMSP (https://old.tcmsp-e.com) ، وأدخل danshen (اسم العشب) ، ثم اضغط على بحث وانقر فوق Radix Salviae في قائمة النتائج.
    2. انقر فوق تنزيل واحد تلو الآخر من العناصر واحفظ البنية ثنائية الأبعاد بتنسيق .mol2.
  2. قم بتنزيل ملف البروتين.
    1. افتح قاعدة بيانات PDB (https://www.rcsb.org/)، وأدخل UCHL3، ثم اضغط على بحث. انقر على Homo sapiens، ثم اضغط على البحث في التحسينات.
    2. حدد الهيكل 1XD3 مع التبلور المشترك للجزيء والبروتين الصغير ، ثم انقر فوق تنزيل الملفات وحدد تنسيق PDB .

2. الإرساء الجزيئي

  1. احفظ الملف.
    1. قم بإنشاء مجلد جديد باسم danshen_UCHL3 الإرساء على سطح المكتب واحفظ مركبات هياكل Salvia miltiorrhiza Bge و UCHL3 في هذا المجلد. قم بتسمية المجلد باللغة الإنجليزية. وإلا، فسيفشل استيراد الملف.
  2. تعيين المسار.
    1. افتح برنامج Maestro ، وانقر فوق File ، وحدد Change Working Directory ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا لتحديد مجلد danshen_CUHL3 docking ، وانقر فوق Choose Options.
  3. معالجة الجزيئات الصغيرة
    1. استيراد هياكل الجزيئات الصغيرة.
      1. انقر فوق خيارات الملف واستيراد البنيات. انقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء ، وانقر فوق ملف هيكل Salvia miltiorrhiza Bge. ثم انقر فوق فتح لاستيراد جميع الجزيئات الصغيرة.
    2. تحضير الجزيء الصغير.
      1. انقر فوق المهام وحدد خيار LigPrep . في نافذة LigPrep المعروضة ، انقر فوق جدول المشروع في خيار استخدام البنية من ، وحدد خيار تحديد التيار اللوني من بنية 3D ضمن الحساب ، واترك جميع إعدادات البرامج الأخرى كافتراضية.
      2. قم بتغيير اسم الوظيفة إلى danshen_ligprep1، ثم انقر فوق تشغيل لتنفيذ معالجة جزيئات صغيرة.
  4. معالجة هيكل البروتين
    1. استيراد هيكل البروتين.
      1. انقر فوق خيارات الملف واستيراد الهياكل ، وانقر فوق سطح المكتب وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد danshen_CUHL3 الإرساء.
      2. انقر فوق ملف بنية البروتين UCHL3 ، ثم انقر فوق فتح لاستيراد ملف بنية البروتين.
    2. تحضير البروتين.
      1. حدد الرابطتين التساهميتين اللتين تربط UCHL3 والجزيء الصغير ، واحذفهما باستخدام الزر حذف . ثم حدد بقايا البروتين غير المكتملة بعد الحذف. انقر فوق الزر "إنشاء" ، وحدد تعديلات أخرى ، ثم بالنسبة إلى Gly75 انقر فوق الزر C ، بالنسبة إلى Cys95 ، اختر Mutate Residue و CYS.
      2. انقر فوق المهام وحدد خيار سير عمل تحضير البروتين . اترك جميع إعدادات البرامج الأخرى كإعدادات افتراضية. قم بتغيير اسم الوظيفة إلى UCHL3_protein مسبقا ، ثم انقر فوق تشغيل لإجراء معالجة البروتين.
    3. قم بإعداد صندوق الإرساء.
      1. انقر فوق المهام ، واختر إنشاء شبكة المستقبلات ، وحدد اختيار لتحديد جزيء الترابط . حدد الجزيء الصغير في workpac e ، وسيظهر صندوق إرساء وردي متمركز على إحداثيات الجزيئات الصغيرة.
      2. احتفظ بالإعدادات الافتراضية، وقم بتسمية الوظيفة على أنها 1XD3_danshen_glide_grid، ثم انقر فوق تشغيل.
        ملاحظة: في 1XD3 ، يشكل الجزيء الصغير رابطة تساهمية مع البروتين. من الضروري إزالة هذه الرابطة التساهمية لفصل الجزيء الصغير عن البروتين. خلاف ذلك ، أثناء عملية إعداد شبكة المستقبلات ، لا يمكن تحديد الجزيء الصغير.
  5. إجراء الإرساء الجزيئي.
    1. انقر فوق المهام وحدد خيار Ligand Docking . حدد شبكة المستقبلات ، وانقر فوق من ملف ، ثم انقر فوق استعراض. حدد 1XD3_danshen_glide_grid.zip الملف، ثم انقر فوق فتح.
    2. انقر فوق استخدام الروابط من كملفات ، ثم انقر فوق استعراض. انقر فوق danshen_ligprep1 الملف، وحدد danshen_ligprep1-out. maegz file، ثم انقر فوق فتح.
    3. انقر فوق الإعدادات وحدد خيار الدقة كSP ، وقم بتغيير اسم الوظيفة إلى danshen_UCHL3_ glidedock _SP ، وانقر فوق تشغيل.
  6. عرض نتائج الإرساء.
    1. انقر فوق خيارات الملف واستيراد البنيات . انقر فوق سطح المكتب وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء danshen_CUHL3.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف _SP glidedock danshen_UCHL3_ ، وانقر فوق ملف danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz ، ثم انقر فوق فتح.
    3. انقر فوق خيار الجدول ، ثم اعرض النتيجة ضمن درجة الإرساء.
  7. تصور تفاعلات danshensu و UCHL3.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz وافتحه في Maestro. في قائمة الدخول ، اضغط مع الاستمرار على Shift وحدد danshensu والبروتين في نفس الوقت.
    2. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد دمج لإنشاء بنية جديدة. حدد البنية الجديدة، وانقر بزر الماوس الأيمن، واختر تصدير، ثم انقر على الهياكل، وقم بتسمية الملف danshensu_UCHL3، وقم بتصديره بتنسيق .pdb.
    3. حدد بنية الدمج في اللوحة ، وانقر فوق المهام ، وحدد 2D sketcher ، واحصل على صورة هيكل ثنائية الأبعاد للتفاعل بين danshensu و UCHL3.
    4. قم باستيراد ملف danshensu_UCHL3.pdb إلى برنامج pymol وتصوره بناء على بنية 2D التي تم الحصول عليها من Maestro.

3. تنقية البروتين UCHL3

  1. بناء بلازميد التعبير بدائي النواة pHUE-UCHL3
    1. الحصول على تسلسل الترميز للبروتين المؤتلف UCHL3 الجين من NCBI (isform2). قم بدمج جزء الجين الذي تم الحصول عليه في ناقل pHUE-10HIS عن طريق إعادة التركيب المتماثل وتحويله إلى خلايا مختصة ب DH5α. استخراج الحمض النووي البلازميد للحصول على البناء المطلوب.
  2. تحريض وتنقية البروتينات المؤتلفة
    1. الثقافة البكتيرية:
      1. قم بتحويل البلازميدات المؤتلفة إلى خلايا مختصة BL21 (DE3) ونشرها على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على الأمبيسلين. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      2. اختر مستعمرات مفردة ، وقم بتلقيحها في 12 مل من وسط LB السائل المكمل ب 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين ، وزرعها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    2. التحول والحث
      1. خفف المزرعة البكتيرية بين عشية وضحاها إلى 2٪ باستخدام وسط جديد. عندما وصل OD600 إلى 0.4-0.6 ، أضف الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوبيرانوزيد (IPTG) إلى التركيز النهائي البالغ 0.4 ملي مولار للحث في درجات الحرارة المنخفضة عند 16 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    3. مجموعة من الثقافة البكتيرية
      1. انقل المزرعة البكتيرية إلى أنابيب طرد مركزي معقمة وأجهزة طرد مركزي عند 2200 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وتخزين السلالات عند -80 درجة مئوية للحفظ.
    4. صوتنة
      1. أعد تعليق السلالة في 25 مل (1/20 من المزرعة البكتيرية المجمعة) من العازلة 1 (50 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي EDTA). أداء صوتنة البكتيريا في ظل الظروف التالية: تشغيل لمدة 4 ثوان ، وإيقاف التشغيل لمدة 6 ثوان ، وضبط الطاقة على 60٪ ، لمدة 15 دقيقة. أضف 1٪ Triton X-100 وLyse عند 4 درجات مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
    5. فصل الطاف والحبيبات
      1. جهاز الطرد المركزي للعينة عند 9000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اجمع المادة الطافية وقم بتصفيتها من خلال مرشح غشائي 0.45 ميكرومتر. احتفظ ب 50 ميكرولتر من المادة الطافية كمدخل.
      2. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت 1 ، وأضف كمية مناسبة من 5x عينة عازلة (25٪ 1M Tris-HCl [درجة الحموضة 6.8] ، 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 0.5٪ بروموفينول أزرق ، 41.67٪ جلسرين ، و 10٪ DL-dithiothreitol) ، واغليها عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. تنقية البروتين
    1. توازن العمود
      1. قم بتحميل 1 مل من راتنج النيكل NiNTA في العمود ، واتركه يستقر لمدة 10 دقائق ، ثم قم بموازنة العمود بالتتابع مع 5 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت 2 (50 ملي مولار HEPES pH 7.5 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم) تحتوي على 10 ملي مولار ، 500 ملي مولار ، و 10 ملي إيميدازول.
      2. استخدم ماصة لإضافة 5 مل (حوالي 5 أحجام أعمدة) من محلول إيميدازول 10 ملي مولار على طول جدار العمود. قم بهذه العملية دون التحكم في معدل التدفق.
      3. بمجرد أن يغطي السائل مادة التعبئة فقط ويتم تصريفه تقريبا ، أضف بالتتابع 5 أحجام أعمدة من محلول إيميدازول 500 ملي مولار ومحلول إيميدازول 10 ملي مولار للتوازن. عندما يغطي محلول إيميدازول المتبقي 10 ملي مولار مادة التعبئة فقط ، أغلق وحدة التحكم في التدفق لإيقاف التوازن.
    2. تنقية البروتين
      1. مرر المادة الطافية للبروتين المصفى عبر العمود بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة (<15 ثانية لكل قطرة) ، وجمع جزء التدفق. قم بإعداد تدرج تركيز 10 ملي مولار و 30 ملي مولار و 50 ملي مولار و 100 ملي مولار إيميدازول باستخدام المخزن المؤقت 2 ، جنبا إلى جنب مع 0.5 ملي كلوريد الصوديوم.
      2. قم بإخراج التركيزات المتتابعة من التركيزات المنخفضة إلى العالية من إيميدازول ، باستخدام ماصة لإضافة ما يقرب من 5 أحجام أعمدة من المحلول على طول جدار العمود دون التحكم في معدل التدفق. اجمع التصريف في أنابيب نظيفة للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، مع أخذ 1 مل من التدفق لكل أنبوب.
      3. بعد جمع خمسة أنابيب ، خذ 1 ميكرولتر من التدفق من كل أنبوب للتفاعل مع 1 ميكرولتر من عازلة برادفورد. إذا ظل رد الفعل أزرق ، فاستمر في الخطوات ؛ إذا أصبح شفافا ، فتوقف عن الشطف عند هذا التركيز وانتقل إلى التركيز التالي.
      4. بعد التصفية بإيميدازول 100 ملي مولار ، اغسل ب 10 أحجام أعمدة من 0.5 M كلوريد الصوديوم دون التحكم في معدل التدفق أو جمع المصف.
      5. أخيرا ، قم بتقطيع 500 ملي مولار إيميدازول (<15 ثانية لكل قطرة). باستخدام ماصة ، أضف 1 مل من المحلول إلى العمود ، مع الحفاظ على معدل الشطف البطيء المذكور أعلاه. اجمع 1 مل من مادة الاسترخاء باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وكرر هذه العملية 10 مرات.
    3. قم بتقييم البروتين المنقى باستخدام تلطيخ Coomassie Brilliant Blue.
      1. حدد كمية الحبيبات التي تم الحصول عليها مسبقا ، والمادة الطافية قبل التنقية ، وأنابيب البروتين ال 10 التي تم جمعها عن طريق أخذ 10 ميكرولتر من كل مجموعة وإضافة المخزن المؤقت المناسب للعينة 5x ، ثم التسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      2. تحضير محلول ألبومين مصل الأبقار القياسي (BSA) عند 1 مجم / مل و 500 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل. ثم أضف المخزن المؤقت المناسب للعينة 5x وقم بتسخينه عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. قم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE على العينات ، ثم قم بإزالة الجل واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) في محلول Coomassie Brilliant Blue على شاكر منخفض السرعة طوال الليل.
      4. في اليوم التالي ، انقل الجل إلى محلول إزالة اللون (40٪ إيثانول ، 10٪ حمض الأسيتيك ، 50٪ H2O) لإزالة اللون ، مع تطبيق حرارة لطيفة حسب الحاجة. بمجرد أن يصبح الجل شفافا ، راقب تحت أداة تطوير لتحديد كمية البروتين المنقى بناء على مستويات BSA وتقييم النقاء عن طريق التحقق من وجود نطاق واحد.
    4. تخزين البروتين: قم بتقطيع البروتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب ، وتجميد سريع في النيتروجين السائل ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية.

4. مقايسة نشاط UCHL3 (مقايسة Ub-AMC)

  1. تحضير البروتين
    1. قم بإذابة البروتين على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 × جم عند RT لمدة 3 دقائق ، وحدد تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA. خفف البروتين إلى تركيز 40 نانومتر باستخدام Buffer 1.
  2. إعداد المجموعات
    1. قم بتعيين Buffer 1 كمجموعة تحكم و UCHL3 كمجموعة تجريبية. أضف 200 ميكرولتر من كل عينة لكل بئر في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، وقم بإعداد 3 مكررات لكل مجموعة.
  3. الكشف
    1. قبل القياس مباشرة ، أضف Ub-AMC بسرعة إلى كل بئر ورجه بقوة لمدة 2-5 ثوان. تركيز Ub-AMC المستخدم هو 250 نانومتر. قم بقياس قيم OD عند الطول الموجي للإثارة 380 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 460 نانومتر في ظل ظروف 37 درجة مئوية ، مع أخذ قراءات كل 30 ثانية لمدة تصل إلى 10 دقائق.

5. مقايسة تثبيط نشاط UCHL3 بواسطة HA-Ub-VS (مقايسة HA-Ub-VS)

  1. تحضير البروتين
    1. قم بإذابة البروتين على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 × جم عند RT لمدة 3 دقائق ، وحدد تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA. خفف البروتين إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل.
  2. تحضير الجزيئات الصغيرة
    1. قم بوزن Danshensu وتخفيفه في تدرج باستخدام ماء عالي النقاء إلى 5 ملم و 1 ملم و 100 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 1 ميكرومتر.
  3. إعداد المجموعات
    1. قم بإعداد مجموعة البروتين النقي والمجموعة التي لا تحتوي على أدوية جزيئات صغيرة كمجموعات تحكم سلبية. استخدم PR619 (مثبط DUB) كمجموعة تحكم إيجابية ، والمجموعات الأخرى كمجموعات معالجة دوائية للجزيئات الصغيرة.
  4. تحضير العينة
    1. وفقا للمجموعة ، أضف بالتتابع 9 ميكرولتر من UCHL3 و 1 ميكرولتر من Dansensu بالتركيزات المقابلة لكل مجموعة معالجة بالدواء. أضف 1 ميكرولتر من PR619 (50 ميكرومتر قيد الاستخدام) إلى مجموعة التحكم الإيجابية. استخدم الماء عالي النقاء والمخزن المؤقت 1 للتعويض عن مجموعة التحكم السلبية.
    2. تخلط جيدا عن طريق الدوامة ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع عينات التفاعل على الجليد ، وأضف HA-Ub-VS إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. أضف كمية مناسبة من 5x عينة عازلة وقم بتسخينها في حمام معدني 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع العينات في RT لمدة 5 دقائق وقم بتحميلها على الجل.

6. اللطخة الغربية

  1. تحضير جل SDS-PAGE
    1. شطف مجموعة من الألواح الزجاجية بالماء فائق النقاء. ضع الألواح في فتحة التثبيت ، ثم على لوح شفاف. أضف الماء عالي النقاء وتحقق من التسرب لمدة 10 دقائق.
    2. تحضير غراء الفصل وفقا لطاولة توزيع الغراء.
    3. صب الماء عالي النقاء من علبة الجل وامتصاص أي ماء متبقي بورق الترشيح. أضف جل الفصل المحضر بنسبة 12٪ بسرعة وبشكل متساو. ثم أضف 1 مل من الأيزوبروبانول وانتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا حتى يتجمد الجل.
    4. تحضير الطبقة العليا من الغراء المركز وفقا لطاولة توزيع الغراء.
    5. قم بإزالة الأيزوبروبانول من الجزء العلوي من الجل المنفصل ، واغسله 3 مرات بماء عالي النقاء ، وجففه بورق الترشيح. أضف جل التكديس المحضر بنسبة 3٪ بسرعة ، وأدخل مشطا 1.0 مم 15 حفرة ، وانتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا.
      ملاحظة: حافظ على المشط عموديا على سطح الغراء ، وتأكد من عدم ظهور فقاعات الهواء.
  2. الرحلان الكهربائي
    1. قم بإزالة المشط رأسيا وصب كمية كافية من المخزن المؤقت الجاري في الغرفة الداخلية لجهاز الرحلان الكهربائي ، مما يضمن أن السائل يغطي آبار العينة.
    2. ضع علامة البروتين والعينات التجريبية المحضرة في RT ، الدوامة جيدا ، ولفترة وجيزة جهاز الطرد المركزي. أضف 3 ميكرولتر من علامة البروتين في أول بئر عينة يسرى ، متبوعة ب 10 ميكرولتر من العينة التجريبية في كل بئر لاحق.
    3. أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت الجاري في الغرفة الخارجية لخزان الرحلان الكهربائي ، وقم بتغطية الخزان بغطاءه ، وقم بتوصيل مصدر الطاقة. تأكد من توصيل مصدر الطاقة بشكل صحيح.
    4. قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الجهد على 80 فولت حتى تتركز العينات في خطوط ، ثم قم بزيادة الجهد إلى 120 فولت بمجرد بدء الفصل في هلام الفصل.
      ملاحظة: أثناء العملية ، تأكد من عدم تكوين فقاعات في الأسفل. إذا ظهرت فقاعات ، قم بإمالة جهاز الرحلان الكهربائي إلى جانب واحد لطردها.
  3. نقل إلى الغشاء
    1. استخدم سكينا بلاستيكيا لفتح كاسيت الجل. قم بقطع زاوية في أعلى اليسار حيث بدأ تحميل العينة في تحديد الاتجاه. انقع الجل وورق الترشيح المطلوب في مخزن النقل المؤقت لمدة 1-2 دقيقة.
    2. قم بقياس وقطع غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) وفقا للحجم المطلوب للبروتين المستهدف. قم بتنشيط غشاء PVDF عن طريق نقعه في الميثانول لمدة 20 ثانية إلى 1 دقيقة ، ثم اغمره بالهلام في مخزن النقل.
    3. صب كمية صغيرة من المخزن المؤقت للنقل في جهاز النقل ، واستخدم الأسطوانة لترطيب وحدة النقل شبه الجافة. رتب المكونات بالترتيب التالي من الأسفل إلى الأعلى: ثلاث طبقات من ورق الترشيح ، والهلام ، وغشاء PVDF ، وثلاث طبقات أخرى من ورق الترشيح.
    4. بعد وضع كل طبقة ، استخدم الأسطوانة لإزالة أي فقاعات. بلل الغطاء بمخزن مؤقت للنقل ثم قم بتغطية الجهاز.
      ملاحظة: تأكد من وجود كمية كافية من المخزن المؤقت للنقل ، مع إضافة كمية صغيرة بعد إكمال كل طبقة. قم بإعداد العلامات مسبقا ، مع التمييز بين الجانبين الأيسر والأيمن من الجل حيث تم تحميل العينات ، وكذلك تحديد الجزء الأمامي والخلفي من الغشاء. بعد وضع كل طبقة ، قم بلفها برفق لإزالة أي فقاعات.
    5. قم بتشغيل مصدر الطاقة ، مما يضمن القطبية الصحيحة. اضبط التيار على 190 مللي أمبير واضبط الوقت على 45 دقيقة.
  4. حظر
    1. تحضير محلول الحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في TBST (1٪ Tween20) كمخزن مؤقت للحظر. ضع غشاء PVDF مع الجانب الأمامي لأعلى في صندوق تهجين ، واسكب 10 مل من المخزن المؤقت للحجب ، ورجه برفق على شاكر منخفض السرعة عند RT لمدة ساعة واحدة للحظر.
  5. حضانة الجسم المضاد الأولي
    1. قم بإعداد الجسم المضاد الأساسي بمحلول الأجسام المضادة1 عند 1: 1000 وأضف 10 مل من الجسم المضاد الأولي إلى صندوق الحضانة الجديد. ضع صندوق الحضانة في غرفة باردة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية واحتفظ به على شاكر طوال الليل.
  6. حضانة الجسم المضاد الثانوي
    1. اجمع الجسم المضاد الأساسي في صندوق الحضانة في اليوم التالي ، ثم أضف محلول TBST المناسب وضعه على شاكر لغسله لمدة 5 دقائق ، كرر 3 مرات.
    2. تحضير الجسم المضاد الثانوي بمحلول حليب 5٪ عند 1: 5000. قم بإسقاط 1 مل من الجسم المضاد الثانوي في قاع صندوق التهجين المبلل. ضع غشاء PVDF بحيث يكون جانب البروتين متجها لأسفل على الجسم المضاد الثانوي ، ثم احتضنه في RT على شاكر منخفض السرعة لمدة 1.5 ساعة.
    3. أضف محلول TBST المناسب وضعه على شاكر لغسله لمدة 5 دقائق ؛ كرر 3 مرات.
  7. تعريض الشرائط
    1. خذ كميات متساوية من الكواشف المضيئة الكيميائية A و B ، ورجه ، واخلطه جيدا. حماية الحل من الضوء.
    2. ضع المحلول النامي بالتساوي على غشاء PVDF ، ورجه برفق لضمان طلاء الغشاء بشكل موحد بالمحلول.
    3. ضع الغشاء في نظام التصوير الهلامي واضبط وقت التعرض وعدد مرات التعرض والمعلمات الأخرى ذات الصلة.
      ملاحظة: يجب على المطور تغطية الشريط بالكامل ، ويجب أن يكون التطوير في بيئة مظلمة.

النتائج

لفحص الجزيئات الصغيرة في Salvia miltiorrhiza Bge التي يمكن أن تمنع UCHL3 بشكل فعال ، أجرينا الالتحام الجزيئي بين الجزيئات الصغيرة التي تم الحصول عليها من موقع TCMSP مع UCHL3. يتم عرض أفضل 30 جزيئا صغيرا في نتائج الإرساء ودرجاتها في الجدول 1. يتم عرض نتائج الإرساء لجميع الجزيئا?...

Discussion

تلعب DUBs دورا مهما في تنظيم التوازن في نظام اليوبيكويتين بأكمله عن طريق إزالة اليوبيكويتين من الركائز أو سلاسل البوليوبيكويتين37. في السنوات الأخيرة ، جذبت هذه الإنزيمات أيضا الكثير من الاهتمام كأهداف لتطوير الأدوية13. ومع ذلك ، هناك تحديات في عم...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في بكين [المنحة رقم 7244498].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

References

  1. Ciechanover, A. The ubiquitin proteolytic system and pathogenesis of human diseases: A novel platform for mechanism-based drug targeting. Biochem Soc Trans. 31 (2), 474-481 (2003).
  2. Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by e1 enzymes: The apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 319-331 (2009).
  3. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (11), 755-764 (2009).
  4. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (10), 626-642 (2016).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: Structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Clague, M. J., et al. Deubiquitylases from genes to organism. Physiol Rev. 93 (3), 1289-1315 (2013).
  7. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: Deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (6), 338-352 (2019).
  8. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: Emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 17 (1), 57-78 (2018).
  9. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of deubiquitinase specificity and regulation. Annu Rev Biochem. 86, 159-192 (2017).
  10. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L., Rose, I. A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (4), 1783-1786 (1980).
  11. Abdul Rehman, S. A., et al. Mindy-1 is a member of an evolutionarily conserved and structurally distinct new family of deubiquitinating enzymes. Mol Cell. 63 (1), 146-155 (2016).
  12. Storer, A. C., Ménard, R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500 (1994).
  13. Lange, S. M., Armstrong, L. A., Kulathu, Y. Deubiquitinases: From mechanisms to their inhibition by small molecules. Mol Cell. 82 (1), 15-29 (2022).
  14. Ndubaku, C., Tsui, V. Inhibiting the deubiquitinating enzymes (dubs). J Med Chem. 58 (4), 1581-1595 (2015).
  15. Schauer, N. J., Magin, R. S., Liu, X., Doherty, L. M., Buhrlage, S. J. Advances in discovering deubiquitinating enzyme (dub) inhibitors. J Med Chem. 63 (6), 2731-2750 (2020).
  16. Magin, R. S., et al. Small molecules as tools for functional assessment of deubiquitinating enzyme function. Cell Chem Biol. 28 (7), 1090-1100 (2021).
  17. Dang, L. C., Melandri, F. D., Stein, R. L. Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin c-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37 (7), 1868-1879 (1998).
  18. Li, Y. T., et al. New semi-synthesis of ubiquitin c-terminal conjugate with 7-amino-4-methylcoumarin. J Pept Sci. 20 (2), 102-107 (2014).
  19. Feng, X., et al. Ubiquitination of UVRAG by SMURF1 promotes autophagosome maturation and inhibits hepatocellular carcinoma growth. Autophagy. 15 (7), 1130-1149 (2019).
  20. Qin, X., et al. Identification of an autoinhibitory, mitophagy-inducing peptide derived from the transmembrane domain of USP30. Autophagy. 18 (9), 2178-2197 (2022).
  21. Borodovsky, A., et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  22. Ovaa, H. Active-site directed probes to report enzymatic action in the ubiquitin proteasome system. Nat Rev Cancer. 7 (8), 613-620 (2007).
  23. Ekkebus, R., Flierman, D., Geurink, P. P., Ovaa, H. Catching a dub in the act: Novel ubiquitin-based active site-directed probes. Curr Opin Chem Biol. 23, 63-70 (2014).
  24. D'arcy, P., et al. Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy. Nat Med. 17 (12), 1636-1640 (2011).
  25. Sucher, N. J. The application of Chinese medicine to novel drug discovery. Expert Opin DrugDiscov. 8 (1), 21-34 (2013).
  26. Jung, I., Kim, H., Moon, S., Lee, H., Kim, B. Overview of salvia miltiorrhiza as a potential therapeutic agent for various diseases: An update on efficacy and mechanisms of action. Antioxidants (Basel). 9 (9), 857 (2020).
  27. Wang, Z., Peters, R. J. Tanshinones: Leading the way into lamiaceae labdane-related diterpenoid biosynthesis. Curr Opin Plant Biol. 66, 102189 (2022).
  28. Bai, M., et al. Astrocytes and microglia-targeted danshensu liposomes enhance the therapeutic effects on cerebral ischemia-reperfusion injury. J Control Release. 364, 473-489 (2023).
  29. Zhang, H., et al. Salvianolic acid a protects RPE cells against oxidative stress through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Free Radic Biol Med. 69, 219-228 (2014).
  30. Wang, R., et al. Danshensu inhibits sars-cov-2 by targeting its main protease as a specific covalent inhibitor and discovery of bifunctional compounds eliciting antiviral and anti-inflammatory activity. Int J Biol Macromol. 257 (Pt 2), 128623 (2024).
  31. Misaghi, S., et al. Structure of the ubiquitin hydrolase UCH-L3 complexed with a suicide substrate. J Biol Chem. 280 (2), 1512-1520 (2005).
  32. Wing, S. S. Deubiquitinating enzymes--the importance of driving in reverse along the ubiquitin-proteasome pathway. Int J Biochem Cell Biol. 35 (5), 590-605 (2003).
  33. Samy, M. A., Abd El Fatah, N. M., Yahia, S. E., Arafa, R. K. Friend or foe: UCHL3 mediated carcinogenesis and current approaches in small molecule inhibitors' development. Curr Med Chem. 28 (42), 8782-8799 (2021).
  34. Hafez, N., Modather El-Awadly, Z., Arafa, R. K. UCH-L3 structure and function: Insights about a promising drug target. Eur J Med Chem. 227, 113970 (2022).
  35. Song, Z., et al. A novel UCHL(3) inhibitor, perifosine, enhances PARP inhibitor cytotoxicity through inhibition of homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Cell Death Dis. 10 (3), 398 (2019).
  36. Hirayama, K., Aoki, S., Nishikawa, K., Matsumoto, T., Wada, K. Identification of novel chemical inhibitors for ubiquitin c-terminal hydrolase-L3 by virtual screening. Bioorg Med Chem. 15 (21), 6810-6818 (2007).
  37. Nijman, S. M., et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell. 123 (5), 773-786 (2005).
  38. Guo, M., et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 12 (4), 1723-1739 (2022).
  39. Chavanieu, A., Pugnière, M. Developments in spr fragment screening. Expert Opin Drug Discov. 11 (5), 489-499 (2016).
  40. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  41. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  42. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
  43. Fan, Z., Wang, S., Xu, C., Yang, J., Cui, B. Mechanisms of action of fu fang gang liu liquid in treating condyloma acuminatum by network pharmacology and experimental validation. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 128 (2023).
  44. Tirat, A., et al. Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2. Anal Biochem. 343 (2), 244-255 (2005).
  45. Hassiepen, U., et al. A sensitive fluorescence intensity assay for deubiquitinating proteases using ubiquitin-rhodamine110-glycine as substrate. Anal Biochem. 371 (2), 201-207 (2007).
  46. Chan, W. C., et al. Accelerating inhibitor discovery for deubiquitinating enzymes. Nat Commun. 14 (1), 686 (2023).
  47. Haj-Yahya, N., et al. Dehydroalanine-based diubiquitin activity probes. Org Lett. 16 (2), 540-543 (2014).
  48. Li, G., Liang, Q., Gong, P., Tencer, A. H., Zhuang, Z. Activity-based diubiquitin probes for elucidating the linkage specificity of deubiquitinating enzymes. Chem Commun (Camb). 50 (2), 216-218 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213 Deubiquitinizing danshensu Ub AMC HA Ub VS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved