تطوير نظام بروتوبلاست الملفوف لدراسة تحمل نقص الأكسجة في الكرنب

Shih-Jie Huang; Fu-Chiun Hsu

doi:10.3791/67444

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف هذا البروتوكول نظام بروتوبلاست الملفوف المتوسط الفعال. تم اختبار العديد من العلاجات التي تعاني من نقص الأكسجين ، وأظهر النظام تنشيطا عاليا للجينات المستجيبة لنقص الأكسجة ، مما يسهل دراسات الآليات الجينية والجزيئية لتحمل الفيضانات في خضروات Brassicaceae .

Abstract

نظرا لأن تغير المناخ يجلب المزيد من الأمطار الغزيرة ، فإن الملفوف ، وهو من الخضروات الرئيسية من نباتات الكرنب ، يواجه خسائر كبيرة في الغلة بسبب إجهاد نقص الأكسجة الناجم عن الفيضانات. لتحديد آليات تحمل الفيضانات في الملفوف ، هناك حاجة إلى منصة متعددة الاستخدامات للدراسات الوظيفية الجينية للتغلب على طبيعة الملفوف المتمردة. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست وبروتوكول تحريض نقص الأكسجة البروتوبلاست المقابل. حقق هذا البروتوكول إنتاجية عالية وسلامة عزل البروتوبلاست من أوراق الملفوف ، مع كفاءة تعداء تتجاوز 40٪ باستخدام ظروف إنزيمية محسنة. للتخفيف من تأثير نقص الأكسجين المحتمل قبل العلاجات ، تم غلي محلول W5 بغاز الأكسجين لزيادة مستويات الأكسجين المذاب. تم اختبار العديد من المواد الكيميائية لضبط مستويات الأكسجين والعلاجات الفسيولوجية لكسح الأكسجين ، بما في ذلك EC-Oxyrase و OxyFluor وكبريتيت الصوديوم وحزمة امتصاص الأكسجين. أظهرت فحوصات اللوسيفيراز المزدوجة أن محفزات جينات استجابة التنفس اللاهوائي BoADH1 و BoSUS1L تم تنشيطها في بروتوبلاستات الملفوف بعد علاجات نقص الأكسجة ، مع أعلى مستوى تحريض لوحظ بعد العلاج بحزمة امتصاص الأكسجين. باختصار ، يوضح نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست جنبا إلى جنب مع علاج نقص الأكسجة منصة فعالة ومريحة. يمكن لهذه المنصة تسهيل دراسات وظيفة الجينات والآليات الجزيئية المرتبطة باستجابات نقص الأكسجة في الملفوف.

Introduction

أدى تغير المناخ العالمي إلى تفاقم الفيضانات ، التي برزت كقضية بالغة الأهمية في جميع أنحاء العالم. شهدت العقود الأخيرة اتجاها تصاعديا في تواتر أحداث الفيضانات ، مما أدى إلى خسائر كبيرة في المحاصيل¹^،². الملفوف (Brassica oleracea var. capitata L.) ، وهو نبات ذو أهمية عالمية كبيرة ، عرضة للآثار الضارة للأمطار الغزيرة ، مما يستلزم تطوير أصناف الملفوف التي تتحمل الفيضانات لضمان الإنتاج المستدام في مواجهة الظواهر الجوية القاسية. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية المرتبطة بإجهاد الفيضانات في الملفوف أمر ضروري لمواجهة هذا التحدي.

لفهم آليات تنظيم الجينات في النباتات في ظل ظروف مغمورة ، تستخدم الخطوط المعدلة وراثيا على نطاق واسع في الدراسات الوظيفية الجينية. ومع ذلك ، فإن هذا النهج مقيد بارتفاع التكاليف والتحول المكثف للوقت وعمليات الاستزراع الفرعي ، فضلا عن كفاءة التحويل المنخفضة في العديد من أنواع المحاصيل ، مما يستلزم تطوير منهجيات بديلة. تم تطبيق أنظمة التعبير العابر القائمة على البروتوبلاست على نطاق واسع في البحوث الجزيئية النباتية كبديل متعدد الاستخدامات وفعال. تسهل هذه الأنظمة التحقيقات في نشاط المروج ، ومسارات الإشارات استجابة للإشارات البيئية ، وتفاعلات البروتين والبروتين أو البروتين والحمض النووي ، والتوطين تحت الخلوي³. تم الإبلاغ عن إنشاء أنظمة التعبير العابر البروتوبلاست ليس فقط في النباتات النموذجية⁴^،⁵ ولكن أيضا في المحاصيل المهمة اقتصاديا مثل قصب السكر⁶ ، والقرنفل⁷ ، وبساتين الفاكهة فالاينوبسيس ⁸ ، والباذنجان⁹. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ هذه الأنظمة بنجاح في النباتات الخشبية ، بما في ذلك Camellia oleifera¹⁰و Populus trichocarpa¹¹. ومع ذلك ، فإن بروتوكولات تطبيق أنظمة البروتوبلاست لدراسة الخضروات الورقية تحت إجهاد نقص الأكسجة الناجم عن الغمر محدودة. لذلك ، تم تطوير بروتوكول متكامل في هذا العمل للمهتمين بدراسة استجابات نقص الأكسجة في الخضروات الورقية باستخدام نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست.

لتنفيذ استجابة نقص الأكسجة الناجم عن الغمر على المستوى الخلوي ، تم استخدام العديد من منهجيات كسح الأكسجين في الدراسات السابقة لمحاكاة بيئات نقص الأكسجة. وتشمل هذه استخدام EC-Oxyrase و OxyFluor وكبريتات الصوديوم والأكياس المستهلكة للأكسجين. يستخدم EC-Oxyrase عادة للعلاج اللاهوائي في خطوط الخلايا البشرية¹² و Arabidopsis protoplasts¹³. تم العثور على OxyFluor ليكون فعالا في التخفيف من التبييض الضوئي الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء التصوير الفلوري للخلايا الحية¹⁴^،¹⁵. تم استخدام كبريتيت الصوديوم في المعالجة اللاهوائية للديدان الخيطية¹⁶ ، ومؤخرا ، في بروتوبلاستيات الأرز ، جنبا إلى جنب مع تقنيات مثل فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)¹⁷. كما أثبتت عبوات امتصاص الأكسجين ، المستخدمة بشكل أساسي في الاستزراع البكتيري اللاهوائي¹⁸ ، فعاليتها في تحفيز تنشيط محفزات ZmPORB1 في بروتوبلاستيات الذرة في ظل الظروف اللاهوائية¹⁹.

يهدف العمل الحالي إلى إنشاء خط أنابيب قوي لعزل بروتوبلاست الملفوف والتعبير العابر. بعد ذلك ، تم تقييم فعالية العديد من العلاجات لضبط الأكسجين من خلال تقييم نشاط المحفز لجينات الاستجابة اللاهوائية باستخدام فحوصات اللوسيفيراز المزدوج. من المتوقع أن يكون البروتوكول الذي تم تطويره في هذه الدراسة ذا قيمة للأبحاث المستقبلية المتعلقة بالغمر أو إجهاد نقص الأكسجة في أنظمة البراسيكا .

Protocol

تم استخدام صنفين تجاريين من الملفوف (B. oleracea var. capitata) في هذه الدراسة: "Fuyudori" و "228". يظهر تمثيل رسومي لسير عمل البروتوكول في الشكل 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير شتلات الملفوف

زرع بذور الملفوف "Fuyudori" و "228" باستخدام الركيزة النباتية التجارية في ثقوب دائرية مربعة الشكل (D 4.5 سم × ارتفاع 4.5 سم) من صواني سدادة 48 بئرا (الطول 49 سم × العرض 28 سم × الارتفاع 5 سم). قم بتضمين البذور بعمق 1 سم تقريبا في وسط النمو.
ازرع شتلات الملفوف في غرفة نمو عند 22 درجة مئوية مع دورة فاتحة وظلامية لمدة 16/8 ساعة. حافظ على شدة الضوء 100 ميكرولتر ^{م -2} ثانية ^-1 (أنبوب الفلورسنت الأبيض) أثناء مرحلة الضوء.
بعد 2-3 أسابيع من النمو ، استخدم شتلات الملفوف في مرحلة 2 ورقة لمزيد من عزل البروتوبلاست المتوسط.
ملاحظة: الحجم المقترح لشتلات الملفوف هو مرحلة من ورقتين ، حيث يتم توسيع الورقة الحقيقية الثانية بالكامل ، ولكن لا يتم توسيع الورقة الحقيقية الثالثة ، وطولها أقصر من 1 سم (الشكل 2 أ). لمزامنة مراحل نمو شتلات الملفوف ، يجب أن تزرع بذور "Fuyudori" قبل يومين تقريبا من البذور "228" نظرا لمعدلات نموها المختلفة. يضمن هذا التعديل نموا ونضجا موحدا بين نباتات الملفوف في المرحلة المطلوبة.

2. عزل بروتوبلاستي الملفوف

تحضير 12.5 مل من محلول الإنزيم (الجدول 1) قبل كل عزل بروتوبلاست.
1. قم بتسخين محلول مسبقا ب 10 ملي مولار MES (درجة الحموضة 5.7) و 0.6 متر من المانيتول عند 55 درجة مئوية. استمر في تسخين المحلول عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد إضافة 1.5٪ Cellulase R10 و 0.75٪ Macerozyme R10.
2. بعد أن يبرد محلول الإنزيم إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ، أضف 10 ملي مولار من كلوريد_{الكالسيوم 2} و 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). قم بتعقيم محلول الإنزيم المحضر في طبق بتري مقاس 9 سم باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
  ملاحظة: يزيد التسخين المسبق للمحلول من قابلية ذوبان الإنزيم ويعطل البروتياز. تختلف تأثيرات الهضم اعتمادا على الأنواع المختلفة من إنزيمات السليولاز. مزيج من Cellulase R10 و Macerozyme R10 مناسب لعزل الملفوف البروتوبلاستي.
اجمع الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا من خمس إلى ثماني شتلات ملفوف ، وقم بتقطيعها إلى شرائح 0.5-1.0 مم باستخدام شفرة حلاقة حادة. انقل شرائح الأوراق على الفور إلى محلول الإنزيم الطازج.
ملاحظة: يعد اختيار أوراق صحية ومخصصة من الملفوف في المرحلة المناسبة أمرا بالغ الأهمية. توفر الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا من شتلات الملفوف في مرحلة 2 ورقة أعلى كفاءة لعزل البروتوبلاست. لا ينصح بالنباتات الناضجة أو الفلقات أو الأوراق القديمة لعزل البروتوبلاست. يمكن لخمس إلى اثنتي عشرة ورقة حقيقية موسعة جيدا أن تنتج بنجاح بروتوبلاست الملفوف في 12.5 مل من محلول الإنزيم. يعتمد عدد الأوراق المطلوبة لعزل البروتوبلاست على الكمية المطلوبة من البروتوبلاست المطلوبة. عادة ما تكون البلاستيات البروتوبلاستية التي يتم الحصول عليها من خمس إلى ثماني أوراق كافية للإجراءات التجريبية اللاحقة.
بعد التسلل بالفراغ في الظلام لمدة 30 دقيقة (الشكل 2 ب) ، احتفظ بشرائح أوراق الملفوف مغمورة في محلول الإنزيم (الشكل 2 ج) في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-16 ساعة أخرى.
ملاحظة: قد يختلف وقت هضم الإنزيم بين أصناف الملفوف ويجب تحسينه وفقا للنمط الجيني المحدد. على سبيل المثال ، يتطلب "Fuyudori" وقتا أطول للهضم (16 ساعة) مقارنة ب "228" (4 ساعات) بسبب الأوراق السميكة من "Fuyudori".
قم بتخفيف المحلول المحتوي على البروتوبلاست بحجم متساو من محلول W5 ، والذي يتكون من 2 ملي مولار من MES (درجة الحموضة 5.7) ، و 154 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 125 ملي مولار من كلوريد_{الصوديوم 2} ، و 5 ملي مولار من كلوريد البترول ، و 5 ملي مولار من الجلوكوز (انظر الجدول 1 للتحضير) ، لوقف الهضم الأنزيمي.
حرر تعليق البروتوبلاست عن طريق الدوران اللطيف أو باستخدام شاكر مداري. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
ملاحظة: البروتوبلاست المعزولة قادرة على المرور عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، بينما يتم الاحتفاظ ببقايا النبات غير المهضومة بواسطة المصفاة ثم إزالتها لاحقا من المعلق. يمكن إعادة استخدام مصافي الخلايا والاحتفاظ بها في 75٪ من الإيثانول بعد الغسيل ، ولكن من الضروري شطف مصافي الخلايا بالكامل بمحلول W5 لإزالة الإيثانول المتبقي قبل الاستخدام.
قم بالطرد المركزي لمحلول البروتوبلاست ب 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل البروتوبلاستات المحببة برفق عن طريق إضافة 10 مل من محلول W5 على طول جدار الأنبوب المخروطي بمعدل تدفق تقريبي يبلغ 1 مل · ثانية ^-1. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، وكرر إجراء الغسيل هذا مرة أخرى لضمان الإزالة الكاملة لمحلول الإنزيم.
أعد تعليق البروتوبلاست في محلول W5 وضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد حضانة الجليد ، قم بإزالة المادة الطافية بواسطة ماصة 1 مل في المرة الواحدة حتى تتم إزالة كل المادة الطافية.
أعد تعليق البروتوبلاست في محلول MMG مبرد مسبقا بالثلج يتكون من 4 ملي مولار من MES (درجة الحموضة 5.7) ، و 0.4 متر من المانيتول ، و 15 ملي مولار من MgCl₂ (انظر الجدول 1 للتحضير).
قم بقياس تركيز البروتوبلاست باستخدام مقياس الدم واضبط التركيز النهائي على 4 × 10⁵ بروتوبلاست · مل ^-1 باستخدام محلول MMG.

3. تعداء البروتوبلاست

امزج الحجم الإجمالي 10 ميكرولتر من البلازميد (5-10 ميكروغرام) (الملف التكميلي 1) مع 100 ميكرولتر من البروتوبلاست (4 × 10⁴ بروتوبلاستات) وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: لتنقية البلازميد من الدرجة النفقة ، يتم استخدام مجموعة البلازميد المتوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة. عادة ما يتم استخدام ما يقرب من 4 × 10⁴ بروتوبلاست في مقايسة مراسل ثنائي اللوسيفيراز. بالنسبة للتجارب على نطاق أوسع ، تتوفر كمية أكبر من البروتوبلاستات للتعداد. على وجه التحديد ، يظهر حوالي 2 × 10⁵ بروتوبلاست منقولة ب 10 ميكروغرام من البلازميد كفاءة تعداء مثبتة تتراوح من 30٪ إلى 40٪.
أضف حجما متساويا (110 ميكرولتر) من محلول PEG المحضر حديثا (انظر الجدول 1 للتحضير) يحتوي على 40٪ بولي إيثيلين جلايكول 4000 (PEG4000) ، و 0.1 متر من CaCl₂ ، و 0.2 متر من المانيتول في محلول البروتوبلاست واخلطه برفق.
احتضان خليط البروتوبلاست في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 440 ميكرولتر من محلول W5 لإنهاء التفاعل.
الطرد المركزي البروتوبلاستات المنقولة عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من محلول W5 المخصب بالأكسجين. انقل البروتوبلاستات المعلقة إلى صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار مطلية مسبقا بنسبة 1٪ BSA.
ملاحظة: يجب أن يكون محلول W5 المستخدم في حضانة الخلايا فقاعات بالأكسجين باستخدام مكثف أكسجين (~ 90٪ أكسجين) متصل بحجر هوائي لمدة 5 دقائق (الشكل 2 د). بعد عملية الأكسجين هذه ، زاد تركيز الأكسجين المذاب النهائي في محلول W5 من 7.84 مجم · ^L-1± 0.05 مجم · ^L-1إلى 29.18 ملغ· ^L-1 ± 0.43 ملغ· ^L-1 ، كما تم قياسه بمقياس الأكسجين المذاب. يعتمد حجم محلول W5 لإعادة تعليق البروتوبلاست المنقول على نوع لوحة زراعة خلايا الأنسجة المستخدمة. بالنسبة لألواح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا أو 24 بئرا ، ينصح بتقليل حجم محلول W5 للتخفيف من إجهاد نقص الأكسجة أثناء الحضانة بسبب العمق الأعمق داخل الآبار. بالنسبة لطلاء BSA ، تلقى كل بئر من لوحة الثقافة 1 مل من محلول BSA بنسبة 1٪ ، والذي سمح له بتغطية الآبار لمدة 10 ثوان. ثم تم التخلص من محلول BSA من كل بئر ، وتم إعادة تعبئة الآبار لاحقا بمحلول W5. يهدف هذا الإجراء إلى إنشاء سطح مؤقت غير ملتصق باستخدام BSA ، مما يمنع بشكل فعال البروتوبلاست من الالتصاق بالسطح البلاستيكي للوحة الاستزراع أثناء الخطوات التجريبية اللاحقة.

4. علاج نقص الأكسجة على بروتوبلاستي الملفوف

إجراء علاجات نقص الأكسجة الكيميائية أو الجسدية مباشرة بعد تعداء البروتوبلاست.
ملاحظة: يوصى بتطبيق علاج نقص الأكسجة مباشرة بعد تعداء البروتوبلاست. قد تؤدي الحضانة المطولة للبروتوبلاست إلى تقليل استجابة نقص الأكسجة اللاحقة.
1. بالنسبة لنقص الأكسجة الناجم كيميائيا عن بروتوبلاست الملفوف ، أضف OxyFluor و EC-Oxyrase وكبريتيت الصوديوم إلى محلول W5 protoplast.
  ملاحظة: كان استخدام 0.6 وحدة · مل ^-1 EC-oxyrase ، و 0.6 وحدة · مل ^-1 OxyFluor ، و 1 جم · مل ^-1 كبريتيت الصوديوم في W5 هي الظروف المختبرة القادرة على إحداث محفز BoADH1 و BoSUS1L (الشكل 3 أ) مع ضرر منخفض لسلامة البروتوبلاست في نوعي الملفوف اللذين تم فحصهما.
2. لنقص الأكسجة الناجم عن الكيس الذي يستهلك الأكسجين ، ضع عبوتين لامتصاص الأكسجين في وعاء لاهوائي سعة 3.5 لتر لخلق بيئة تعاني من نقص الأكسجين.
حصاد البروتوبلاست المعالج بنقص الأكسجة عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بتجميد البروتوبلاست الذي تم جمعه باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في فريزر -80 درجة مئوية لإجراء فحوصات لاحقة.

5. اختبار لوسيفيراز مزدوج

قم بإجراء فحص مراسل اللوسيفيراز المزدوج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديل طفيف.
1. أعد تعليق بروتوبلاستي الملفوف في 50 ميكرولتر من 1x عازلة التحلل السلبي والدوامة لمدة 10 ثوان.
2. احتضان البروتوبلاستات المعطلة على الجليد لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. أضف 20 ميكرولتر من محللة الخلية إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من كاشف فحص لوسيفيراز II في الآبار وقم بقياس نشاط لوسيفيراز اليراع باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
4. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الفحص المتاح تجاريا إلى كل بئر وقم بقياس نشاط Renilla luciferase باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

النتائج

نجح هذا العمل في تطوير نظام تعبير عابر باستخدام بروتوبلاستات الملفوف (انظر الشكل 1 لسير العمل). تم عزل البروتوبلاست من أوراق الملفوف الحقيقية التي يبلغ عمرها 2 إلى 3 أسابيع ذات الحجم المناسب (الشكل 2 أ) من أصناف الملفوف التجارية "Fuyudori" و "228" ب?...

Discussion

يقدم هذا البروتوكول طريقة مبسطة لعزل البروتوبلاست من صنفين تجاريين من الملفوف. يتم تقييم فعالية هذه الطريقة بشكل أساسي من خلال معلمتين حاسمتين لمراقبة الجودة: إنتاجية البروتوبلاست القابلة للحياة وكفاءة تعداء البروتوبلاست. أدى تنفيذ هذا البروتوكول إلى عائد يتجاوز 4.00 × ...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (MOST 111-2313-B-002-029- و NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). بالنسبة للشكل 1 ، تم الحصول على الرموز التجريبية من BioRender.com.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation

References

Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021 (2016).
Voesenek, L. a. C. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057 (2022).
Lin, H. -. Y., Chen, J. -. C., Fang, S. -. C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303 (2022).
Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885 (2023).
Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908 (2012).
Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
Cho, H. -. Y., Chou, M. -. Y., Ho, H. -. Y., Chen, W. -. C., Shih, M. -. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863 (2022).
Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892 (2016).
Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
Lin, C. -. C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229 (2023).
Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BoADH1 BoSUS1L

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: