اختبار كفاءة الترجمة باستخدام ملفات تعريف البوليسوم تحت الإجهاد الحراري

Summary

يتضمن البروتوكول المقدم هنا التنميط متعدد الجذور لعزل الترانسلاتوم ، mRNAs المرتبطة بالريبوسومات ، إلى الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور من نبات الأرابيدوبسيس من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. توضح هذه الطريقة كفاءة ترجمة نبات الأرابيدوبسيس المجهد بالحرارة.

Abstract

يعد التحكم الانتقالي للجينات المختلفة تحت الإجهاد الحراري خطوة حاسمة لتكيف النبات مع البيئة. يمكن أن يساعدنا تقييم الأنشطة الانتقالية للجينات المختلفة في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء مرونة النبات ، مما يساهم في تطوير المحاصيل مع تعزيز تحمل الإجهاد في مواجهة تغير المناخ العالمي. تقدم هذه الورقة منهجية مفصلة لتقييم كفاءة الترجمة من خلال التنميط متعدد الجدولة في النباتات المعرضة للإجهاد الحراري. ينقسم الإجراء إلى ثلاثة أجزاء: معالجة الإجهاد الحراري لنبات الأرابيدوبسيس ، واختبار كفاءة الترجمة باستخدام ملامح متعددة الأشكال ، وحساب كفاءة الترجمة عن طريق عزل الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور بناء على الملف الشخصي. في الجزء الأول ، تتعرض نباتات نبات الأرابيدوبسيس لظروف الإجهاد الحراري المتحكم فيها لتقليد التحديات البيئية. يتضمن العلاج تعريض النباتات لدرجات حرارة عالية لفترات محددة ، مما يضمن تحريض إجهاد ثابت وقابل للتكرار. هذه الخطوة ضرورية لدراسة الاستجابات الفسيولوجية والجزيئية للنبات للإجهاد الحراري. يتضمن الجزء الثاني اختبار كفاءة الترجمة باستخدام التنميط متعدد الجدول. يتم استخراج البوليسومات من خلال الطرد المركزي المتدرج للسكروز ، والذي يفصل بين mRNAs بناء على التحميل الريبوزي. يسمح ذلك بفحص احتلال الريبوسوم على mRNAs ، مما يوفر رؤى حول آليات التحكم الانتقالية في ظل ظروف الإجهاد. في الجزء الثالث ، يتم عزل الحمض النووي الريبي عن كل من الكسور متعددة الجذور وغير متعددة الحدود. يستخدم الحمض النووي الريبي المرتفع لقياس كمية الحمض النووي الريبي في كل جزء بدقة. يتم حساب كفاءة الترجمة من خلال مقارنة توزيع mRNAs عبر هذه الكسور في ظل الظروف العادية والإجهاد الحراري. يتم تقييم أنشطة الترجمة لجينات معينة بشكل أكبر من خلال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) مع الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم والحمض النووي الريبي الكلي. تركز هذه المنهجية حصريا على تأثيرات الإجهاد الحراري ، وتوفر بروتوكولا مفصلا لتحليل التنظيم الانتقالي في النباتات.

Introduction

تعد الترجمة أمرا بالغ الأهمية للكائنات الحية لتصنيع البروتينات الوظيفية من mRNA ، ودعم الوظائف الخلوية الأساسية والعمليات البيولوجية مثل التمثيل الغذائي والإشارات وتمكين استجابات الإجهاد. بدون ترجمة ، لا يمكن للخلايا إنتاج بروتينات حيوية ، مما يؤثر على هيكلها ووظيفتها وتنظيمها ، مما يؤثر على الحفاظ على الحياة وتعزيز التنوع البيولوجي^1،2. لذلك ، فإن دراسة الكفاءة الانتقالية للنباتات أمر بالغ الأهمية. تتضمن الترجمة عدة خطوات أساسية. أولا ، يحدث البدء عندما يرتبط mRNA بالريبوسوم ، ويتم تسهيله بواسطة عوامل البدء مثل eIFs في حقيقيات النوى ، والتي تحدد كودون البداية ، عادة AUG. بعد ذ....

Protocol

1. تحضير عينة شتلات نبات الأرابيدوبسيس المعالجة بالإجهاد الحراري

1. لوحة 250 بذرة لكل تكرار وكل حالة مع قطارة على ورق الترشيح الموضوعة على لوحة أجار الوسائط القاعدية Murashige و Skoog (MS) بدون سكروز (درجة الحموضة 5.6) مكملة بنسبة 1.2٪ نباتية.
   ملاحظة: لزراعة الشتلات على ألواح MS ، يتم وضع ورق ترشيح معقم على اللوحة لمنع جذور الشتلات من التغلغل بعمق في الوسط ، مما يسهل أخذ العينات. ثم تزرع البذور فوق ورق الترشيح. لاستبعاد تأثير السكريات على نمو النبات والنتائج التجريبية ، يوصى باستخدام وسيط MS لا يحتوي على السكروز للزراعة.
2. لف لوحة MS التي تحتوي على بذور مزرو....

النتائج

نمت النوع البري من نبات الأرابيدوبسيس ، Col-0 ، على وسط MS تحت فترة ضوئية 16 ساعة: 8 ساعات. للتحكم ، تم استخدام شتلات عمرها 5 أيام بدون معالجة الإجهاد الحراري. خضعت مجموعة الإجهاد الحراري لمدة ساعة واحدة من المعالجة الحرارية عند 40 درجة مئوية في حمام مائي مسخن مسبقا ، بينما ?.......

Discussion

يحدد هذا البروتوكول طريقة مباشرة وموحدة لقياس كفاءة ترجمة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. تتمثل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في ضمان استقرار الحمض النووي الريبي من خلال الطرد المركزي الثانوي واستخراج كاشف استخراج الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى التحضير الدقيق لتدرج ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile