JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتضمن البروتوكول المقدم هنا التنميط متعدد الجذور لعزل الترانسلاتوم ، mRNAs المرتبطة بالريبوسومات ، إلى الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور من نبات الأرابيدوبسيس من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. توضح هذه الطريقة كفاءة ترجمة نبات الأرابيدوبسيس المجهد بالحرارة.

Abstract

يعد التحكم الانتقالي للجينات المختلفة تحت الإجهاد الحراري خطوة حاسمة لتكيف النبات مع البيئة. يمكن أن يساعدنا تقييم الأنشطة الانتقالية للجينات المختلفة في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء مرونة النبات ، مما يساهم في تطوير المحاصيل مع تعزيز تحمل الإجهاد في مواجهة تغير المناخ العالمي. تقدم هذه الورقة منهجية مفصلة لتقييم كفاءة الترجمة من خلال التنميط متعدد الجدولة في النباتات المعرضة للإجهاد الحراري. ينقسم الإجراء إلى ثلاثة أجزاء: معالجة الإجهاد الحراري لنبات الأرابيدوبسيس ، واختبار كفاءة الترجمة باستخدام ملامح متعددة الأشكال ، وحساب كفاءة الترجمة عن طريق عزل الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور بناء على الملف الشخصي. في الجزء الأول ، تتعرض نباتات نبات الأرابيدوبسيس لظروف الإجهاد الحراري المتحكم فيها لتقليد التحديات البيئية. يتضمن العلاج تعريض النباتات لدرجات حرارة عالية لفترات محددة ، مما يضمن تحريض إجهاد ثابت وقابل للتكرار. هذه الخطوة ضرورية لدراسة الاستجابات الفسيولوجية والجزيئية للنبات للإجهاد الحراري. يتضمن الجزء الثاني اختبار كفاءة الترجمة باستخدام التنميط متعدد الجدول. يتم استخراج البوليسومات من خلال الطرد المركزي المتدرج للسكروز ، والذي يفصل بين mRNAs بناء على التحميل الريبوزي. يسمح ذلك بفحص احتلال الريبوسوم على mRNAs ، مما يوفر رؤى حول آليات التحكم الانتقالية في ظل ظروف الإجهاد. في الجزء الثالث ، يتم عزل الحمض النووي الريبي عن كل من الكسور متعددة الجذور وغير متعددة الحدود. يستخدم الحمض النووي الريبي المرتفع لقياس كمية الحمض النووي الريبي في كل جزء بدقة. يتم حساب كفاءة الترجمة من خلال مقارنة توزيع mRNAs عبر هذه الكسور في ظل الظروف العادية والإجهاد الحراري. يتم تقييم أنشطة الترجمة لجينات معينة بشكل أكبر من خلال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) مع الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم والحمض النووي الريبي الكلي. تركز هذه المنهجية حصريا على تأثيرات الإجهاد الحراري ، وتوفر بروتوكولا مفصلا لتحليل التنظيم الانتقالي في النباتات.

Introduction

تعد الترجمة أمرا بالغ الأهمية للكائنات الحية لتصنيع البروتينات الوظيفية من mRNA ، ودعم الوظائف الخلوية الأساسية والعمليات البيولوجية مثل التمثيل الغذائي والإشارات وتمكين استجابات الإجهاد. بدون ترجمة ، لا يمكن للخلايا إنتاج بروتينات حيوية ، مما يؤثر على هيكلها ووظيفتها وتنظيمها ، مما يؤثر على الحفاظ على الحياة وتعزيز التنوع البيولوجي1،2. لذلك ، فإن دراسة الكفاءة الانتقالية للنباتات أمر بالغ الأهمية. تتضمن الترجمة عدة خطوات أساسية. أولا ، يحدث البدء عندما يرتبط mRNA بالريبوسوم ، ويتم تسهيله بواسطة عوامل البدء مثل eIFs في حقيقيات النوى ، والتي تحدد كودون البداية ، عادة AUG. بعد ذلك ، يستمر الاستطالة كجزيئات نقل الحمض النووي الريبي (tRNA) ، كل منها يحمل أحماضا أمينية محددة ، ترتبط بالتتابع بالريبوسوم. تتشكل روابط الببتيد بين الأحماض الأمينية المجاورة ، مما يؤدي إلى إطالة سلسلة عديد الببتيد وفقا لتسلسل mRNA. أخيرا ، يبدأ الإنهاء عند مواجهة كودون التوقف (UAA أو UAG أو UGA) ، الذي يتم التعرف عليه من خلال عوامل الإطلاق التي تدفع الريبوسوم إلى إطلاق البروتين المركب حديثا. خلال الترجمة ، تعمل عوامل البدء حقيقية النواة المختلفة (eIFs) وعوامل الاستطالة والحمض النووي الريبي الريبوسومي معا لضمان الدقة والكفاءة3،4.

أشارت الدراسات السابقة إلى أن التعديلات اللاحقة للترجمة تلعب دورا مهما في تنظيم التفاعلات بين eIFs وبالتالي تؤثر على كفاءة الترجمة. كشفت الأبحاث المختبرية أن فسفرات كيناز الكازين 2 (CK2) eIF3c و eIF5 و eIF2β لزيادة تفاعلاتها مع بعضها البعض ومع eIF15،6. في الظلام ، يمنع E3 ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) الترجمة عن طريق تثبيط الفسفرة بوساطة TOR ل S6K-RPS6. RPS6 غير الفسفوري غير قادر على تكوين ريبوسومات وظيفية ، وبالتالي يوقف الترجمة7. على العكس من ذلك ، في ظل ظروف الإضاءة ، فإن PRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) فسفريلات كيناز eIF2α لتسهيل تجميع مركب eIF2 وتعزيز بدءالترجمة 8. تسلط هذه النتائج الضوء على آليات التحكم المعقدة التي تنظم الترجمة استجابة للإشارات البيئية.

يمكن للمنبهات البيئية المعتدلة أن تعزز بشكل فعال العمليات الانتقالية لتسهيل النمو ، مثل التشكل الضوئي8،9. ومع ذلك ، عندما تكون العوامل البيئية مفرطة ، تحتاج النباتات غير المتحركة إلى تطوير آليات تنظيمية مناسبة للتخفيف من الأضرار الناجمة عن الإجهادالبيئي 10. في الدراسات السابقة المتعلقة باستجابات إجهاد النبات ، ركزت الغالبية على التنظيم عند مستويات التمثيل الغذائي والهرموني والنسخ11،12،13،14. ومع ذلك ، فقد بدأت الأبحاث الحديثة في تسليط الضوء على تأثير التنظيم الانتقالي على تحمل الإجهاد النباتي15،16،17. يمكن للنباتات زيادة تحملكها للإجهاد عن طريق تقليل الكفاءة الانتقالية ، وبالتالي تقليل استهلاك الطاقة غير الضروري. نظرا لتكوين حبيبات الإجهاد غير الغشائية في الخلايا النباتية ، تتجمع الحمض النووي الريبي المرسال غير المترجم والبروتينات المرتبطة بها لتقليل الكفاءة الانتقالية18. أحد الضغوط البيئية الشائعة التي تواجهها النباتات غالبا هو الإجهاد الحراري ، والذي تم الإبلاغ عنه أنه يحفز تكوين حبيبات الإجهاد داخل الخلاياالنباتية 19،20. تؤثر الزيادة العالمية في متوسط درجات الحرارة بسبب الاحتباس الحراري بشدة على غلة المحاصيل21. لذلك ، فإن دراسة التنظيم الفسيولوجي للنباتات تحت الإجهاد الحراري أمر بالغ الأهمية. أظهرت دراسة سابقة أن المعالجة الحرارية للقمح أدت إلى انخفاض في mRNA المرتبط بالبوليسوم. ومع ذلك ، تم إطلاق mRNAs المخزنة في حبيبات الإجهاد وإعادة ربطها بالريبوسومات ، مما يسهل الترجمة بعد الاسترداد22. بالإضافة إلى ذلك ، قارنت الأبحاث السابقة التعبير الجيني بين إجمالي mRNA و mRNA المرتبط بالبوليسوم في النباتات المغمورة16. أشارت النتائج إلى أن مستويات الحالة المستقرة من mRNA المرتبطة بحمض الأبسيسيك واستجابات الإجهاد اللاأحيائي زادت بشكل طفيف بعد الغمر. علاوة على ذلك ، زادت كمية mRNAs المرتبطة بالبوليسوم بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن تنظيم الترجمة قد يلعب دورا أكثر أهمية في التحكم في تحمل الإجهاد في النباتات. لذلك ، تعد طريقة عزل الحمض النووي الريبي المتعددة الأطراف الفعالة أمرا بالغ الأهمية لدراسة ترجمة العينات المعالجة بالإجهاد.

في هذا البروتوكول ، قمنا بتعديل طريقة عزل الحمض النووي الريبي من استخراج الفينول / الكلوروفورم عالي الخطورة والضخم باستخدام طريقة ترسيب LiCl إلى طريقة استخراج ثيوسيانات الفينول / الجوانيدينيوم على نطاق صغير ، والتي تتطلب حجما أقل. تتضمن الطريقة الأولى الخلط المباشر مع الكسور متعددة الأجسام ، مما يؤدي إلى نفايات تجريبيةأكبر 9،15،23. في المقابل ، يستخدم هذا النهج المعدل مبادئ الكثافة التفاضلية: يتم خلط الحمض النووي الريبي متعدد الوحدات أولا بمحلول عالي الملح وخالي من السكر ثم يتم ترسيبه عن طريق الطرد المركزي الفائق. بعد ذلك ، يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام كمية صغيرة من كاشف ثيوسيانات الفينول / الجوانيدينيوم. تقلل هذه الطريقة بشكل فعال من توليد النفايات العضوية ، مما يجعل تجربتنا أكثر صداقة للبيئة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المذيبات العضوية المستخدمة لها سمية أقل. قادتنا هذه الأسباب إلى تعديل وتحسين الإجراءات التجريبية وفقا لذلك. بالإضافة إلى ذلك ، لم توفر الطرق السابقة بروتوكولا شاملا لحساب كفاءات الترجمة باستخدام التطبيع المرتفع ، وهو أمر ضروري لمزيد من التحليلات عبر الذرية المتعمقة.

هنا ، نصف التنميط متعدد الجمرات وبروتوكول عزل الحمض النووي الريبي متعدد الأشكال للتحقيق في كفاءة الترجمة والتحليلات عبر الذرية في نبات الأرابيدوبسيس تحت إجهاد الصدمة الحرارية. تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم كفاءة الترجمة في النوع البري Col-0 في ظل الظروف العادية والصدمة الحرارية وما بعد الاسترداد. كشفت نتائج التنميط المتعدد الجمرات والنسبة المئوية للحمض النووي الريبي متعدد الجذور عن تغييرات في كفاءة الترجمة بعد معالجة الإجهاد الحراري في شتلات نبات الأرابيدوبسيس .

Protocol

1. تحضير عينة شتلات نبات الأرابيدوبسيس المعالجة بالإجهاد الحراري

  1. لوحة 250 بذرة لكل تكرار وكل حالة مع قطارة على ورق الترشيح الموضوعة على لوحة أجار الوسائط القاعدية Murashige و Skoog (MS) بدون سكروز (درجة الحموضة 5.6) مكملة بنسبة 1.2٪ نباتية.
    ملاحظة: لزراعة الشتلات على ألواح MS ، يتم وضع ورق ترشيح معقم على اللوحة لمنع جذور الشتلات من التغلغل بعمق في الوسط ، مما يسهل أخذ العينات. ثم تزرع البذور فوق ورق الترشيح. لاستبعاد تأثير السكريات على نمو النبات والنتائج التجريبية ، يوصى باستخدام وسيط MS لا يحتوي على السكروز للزراعة.
  2. لف لوحة MS التي تحتوي على بذور مزروعة بورق الألمنيوم لحجب الضوء واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة يومين للحث على التبخير.
  3. انقل البذور المبخرية إلى غرفة نمو لتنمو في أقل من 16 ساعة: 8 ساعات ، فترة ضوئية فاتحة داكنة عند 22 درجة مئوية مع شدة ضوء تبلغ 100 ميكرولتر / م2 / ثانية.
  4. بالنسبة لعينات الإجهاد الحراري ، أغلق ألواح MS المتوسطة التي تحتوي على شتلات عمرها 5 أيام بشريط لاصق مقاوم للماء وضعها في حمام مائي 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. بالنسبة للعينات التي تتعافى بعد المعالجة الحرارية ، قم بتبريد الألواح مباشرة بعد المعالجة الحرارية. بعد ذلك ، ضعها في غرفة نمو عند 22 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  6. احصد 250 شتلة معالجة أو غير معالجة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل لكل تكرار وقم بتجميد العينات في النيتروجين السائل على الفور.
    ملاحظة: لكل حالة ، تم إعداد مجموعتين من العينات. أحدهما لتحليلات التنميط متعدد الجسيمات ، والآخر لاستخراج الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور والصومات.

2. إعداد التدرج السكروز

  1. تحضير محلول التدرج الذي يحتوي على التركيزات التالية من السكروز: 12.5٪ ، 24.4٪ ، 36.3٪ ، 48.1٪ ، 60٪. تشتمل تركيبة المحلول على 50 ملي مولار Tris-HCl ، و 25 ملي مولار KCl ، و 10 ملي مولار MgCl2 ، و 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (CHX).
  2. قم بتحميل محاليل التدرج من التركيز العالي إلى المنخفض ، بدءا من الأسفل والتحرك لأعلى. بعد إضافة كل تركيز من محلول التدرج ، قم بتجميد المحلول إلى حالة صلبة قبل إضافة التركيز التالي. لكل تركيز من تدرج السكروز ، أضف 2.2 مل. ستؤدي هذه العملية إلى تدرج كثافة السكروز المتقطع.
  3. قم بتخزين تدرج السكروز المحضر مؤقتا عند -80 درجة مئوية ويذوب طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

3. تحضير عينة التنميط متعدد الأشكال

  1. قم بطحن 250 شتلة Col-0 عمرها 5 أيام ، سواء كانت مصابة بالضغط الحراري أو غير المعالجة ، والتي تم تجميدها مسبقا إلى مسحوق باستخدام الخالط بتردد 30 دورة / ثانية لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: عندما يكون عدد النباتات ذات الخلفية نفسها متساويا ، يكون لها نفس عائد استخراج الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، عند مقارنة النباتات المعدلة وراثيا أو المتحولة ذات الخلفيات المختلفة ، يجب تعديل كمية النباتات المستخدمة وفقا لظروف النبات.
  2. للحصول على محلول استخلاص يحتوي على الحمض النووي الريبي غير المتعدد الجذور ومتعدد الصومات ، أضف 500 ميكرولتر من محلول استخلاص البولي سوم (200 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد كوتاميل ، 25 ملي ملي MgCl2 ، 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد ، 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، 2٪ PTE ، 10٪ DOC ، 400 U / مل مثبط ريبونوكلياز) لكل أنبوب ، واخلط العينات عن طريق العكس والدوامة. تأكد من الحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية طوال العملية.
  3. جهاز الطرد المركزي محلول الاستخراج عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر للحصول على محلول استخراج واضح وخالي من الجسيمات.
    ملاحظة: قد تترسب الجسيمات الموجودة في محلول الاستخراج أثناء الطرد المركزي الفائق ، مما قد يشكل حبيبات يمكن أن تؤثر على دقة قياسات التنميط متعدد الجدول.
  4. قم بتحميل المادة الطافية المفلترة على تدرج السكروز المعد مسبقا وتأكد من وصوله إلى التوازن.
    ملاحظة: نظرا لسرعة الدوران العالية لجهاز الطرد المركزي الفائق ، من الضروري ضمان السلامة والأداء السليم لجهاز الطرد المركزي الفائق. لتحقيق ذلك ، من الضروري التأكد من أن أوزان العينة متطابقة قبل الدوران. لذلك ، نستخدم ميزان دقيق للتحقق من أن أوزان التدرجات موحدة تماما.
  5. جهاز الطرد المركزي تدرج السكروز المحمل بعينات عند 4 درجات مئوية ، 210،000 × جم لمدة 3.5 ساعة باستخدام دوار دلو متأرجح بالطرد المركزي الفائق. اضبط معدلات التسارع والتباطؤ على الحد الأقصى. بعد الطرد المركزي الفائق ، يتم توزيع الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور وفقا لكثافتها في محلول تدرج السكروز المقابل.
    ملاحظة: في تدرج السكروز ، يوزع الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور مع كثافة أقل في الطبقة العليا ، بينما يوزع الحمض النووي الريبي متعدد الصومات ، الذي يتميز بكثافة أعلى بسبب وجود العديد من الريبوسومات العاملة في الترجمة النشطة على الرنا المرسال ، في الطبقة السفلية. بعد ذلك ، يمكن قياس التنميط متعدد الجسيمات باستخدام تجزئة تدرج الكثافة.

4. تحليل التنميط متعدد الجسور

ملاحظة: يتم استخدام مجزأ تدرج الكثافة مع مضخة حقنة صغيرة الحجم لقياس توصيف البوليسوم.

  1. قم بإعداد محلول المطاردة (70٪ سكروز ، 10٪ جلسرين ، و 0.02٪ بروموفينول أزرق) لمضخة الحقنة ذات الحجم الصغير.
  2. استخدم برنامجا للتحكم في تجزئة تدرج الكثافة. معايرة الماكينة باستخدام الماء منزوع الأيونات. بعد المعايرة ، استخدمه لإجراء التنميط متعدد الجسم.
    1. لإجراء ضبط خط الأساس، قم بتشغيل الأشعة المرئية/VISDetector حتى يتغير الضوء من الأحمر إلى الأخضر. اضبط مقبض إزاحة المسجل لمحاذاة خط التحديد، ثم قم بتدوير مقبض ضبط خط الأساس إلى الحد الأدنى لموضع الفتح. اضبط مقبض الحساسية في كاشف الأشعة فوق البنفسجية / VISDETECTOR على المستوى 2.0 واضغط على زر Auto Baseline . أخيرا ، استخدم مقبض إزاحة المسجل لضبط خط الأساس المطلوب إلى 20. ستختلف العملية المعايرة اعتمادا على العلامة التجارية للآلية والعينات المختلفة.
  3. بعد الطرد المركزي الفائق ، ضع الأنابيب مع العينات على مجزأ تدرج الكثافة باستخدام نظام ثقب الأنبوب بحيث يمكن توصيل الأنبوب بمضخة الحقنة بمحلول المطاردة وكاشف الأشعة فوق البنفسجية.
  4. قم بتبديل مجزأ تدرج الكثافة إلى وضع التحكم في البرنامج (REMOTE) واضبط معدل تدفق الحقن لمضخة الحقنة ذات الحجم الصغير على 3 مل / دقيقة.
  5. ابدأ إعدادات البرنامج للبدء والحصول على الرسم البياني لملف تعريف متعدد الأشكال باستخدام المجزأ عن طريق قياس OD254.

5. عزل الحمض النووي الريبي غير المتعدد الجذور ومتعدد الجذور

ملاحظة: في هذا الجزء من البروتوكول ، تم استخدام مجموعة مختلفة من العينات من نفس الدفعة بعد إجراء الطرد المركزي الفائق باتباع نفس الخطوات الموضحة سابقا.

  1. بناء على نتائج قياس ملف تعريف متعدد الجسيمات ، اجمع كسور الحمض النووي الريبي غير متعددة الجذور وكسور الحمض النووي الريبي متعدد الجذور بشكل منفصل. احسب أحجام المحلول لكل من الكسور غير متعددة الجذور والكسور المتعددة الجذور واجمع الجزء غير متعدد الجذور (الجزء العلوي).
    ملاحظة: وفقا للملفات الشخصية ، يتم تعريف الكسر الذي يحتوي على أكثر من اثنين من الريبوسومات على أنه جزء متعدد الجذور ، في حين يتم تعريف الكسر الذي يحتوي على قمم 40S و 60S و 80S rRNA على أنه جزء غير متعدد الصولام.
  2. امزج الأجزاء المستهدفة من الحمض النووي الريبي جيدا مع محلول ملح عالي البرد 2x (400 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 100 ملي مولار KCl ، 50 ملي ملي MgCl2).
  3. أضف 8 ميكرولتر من المخزون المخفف من التحكم في الحمض النووي الريبي Poly-A حقيقيات النواة من المجموعة.
    ملاحظة: لتسوية الارتفاع المطلوب للخطوة السابعة. تشتمل مجموعة التحكم في الحمض النووي الريبي Poly-A حقيقية النواة على جينات B. subtilis ، مثل جين DAP غير الموجود في النباتات ، كجينات مرجعية. لتحديد نسبة فقدان الجينات المرجعية أثناء التفاعل بعد الاستخراج ، أضف كمية متساوية من الكاشف الذي يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي لجين DAP إلى أنابيب مختلفة مع الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور أو متعدد الجذور قبل الاستخراج. يسمح هذا بتحديد نسبة فقدان الجينات المرجعية أثناء التفاعل بعد الاستخراج ويمكن استخدامه لأغراض التطبيع.
  4. جهاز الطرد المركزي محلول عالي الملح يخلط الحمض النووي الريبي عند 4 درجات مئوية ، 450،000 × جم ، لمدة 5 ساعات باستخدام دوار دلو متأرجح بالطرد المركزي الفائق.
  5. بعد الطرد المركزي الفائق ، سوف يترسب الحمض النووي الريبي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. اسكب المادة الطافية بحذر من الأعلى للحفاظ على حبيبات الحمض النووي الريبي في الأسفل.
  6. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بسرعة ب 500 ميكرولتر من الماء المعالج بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) ، وكرر هذه الخطوة 3x.
    ملاحظة: لمنع المياه المعالجة DEPC من إعادة إذابة الحمض النووي الريبي أثناء عملية الغسيل ، من الضروري تبريد الماء المعالج ب DEPC مسبقا قبل الاستخدام لتقليل قابليته. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تقليل وقت التلامس بين المياه المعالجة DEPC وحبيبات الحمض النووي الريبي أثناء الغسيل.

6. استخراج الحمض النووي الريبي غير المتعدد الجذور ومتعدد الجذور

  1. أضف 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي واخلطه مع عينة الحمض النووي الريبي المراد استخراجها. احتضن لمدة 10 دقائق.
  2. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 10 دقائق لفصل الطور.
  3. جهاز الطرد المركزي خليط التفاعل عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل الطبقة المائية الصافية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد ، واخلطها برفق مع حجم متساو من الأيزوبروبانول ، واحتضانها عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين لهطول الحمض النووي الريبي.
  4. بعد هطول الأمطار ، جهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية واحتفظ بحبيبات الحمض النووي الريبي في الأسفل.
  5. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي ب 1 مل من الإيثانول 75٪ قبل البرودة. جهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 12,000 × جم لمدة 10 دقائق ، تخلص من المادة الطافية ، وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء.
  6. بمجرد تجفيف حبيبات الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء المعالج ب DEPC وقم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي (OD260) باستخدام مقياس الطيف الضوئي الكامل (220 نانومتر -750 نانومتر).

7. تطبيع سبايك في

  1. استخدم 1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج للنسخ العكسي باستخدام مجموعة qPCR باتباع تعليمات الشركة المصنعة. يجب نسخ كل من الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور إلى الحمض النووي (cDNA).
  2. امزج 1 ميكرولتر من (كدنا) مع بادئات جينات DAP واستخدم المخزن المؤقت SYBR لقياس مستوى التعبير عن الجين المستهدف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للكشف عن التعبير الجيني DAP .
    ملاحظة: تسلسل بادئات جين DAP هي كما يلي:
    التمهيدي الأمامي = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
    التمهيدي العكسي = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3 '
  3. قارن مستويات التعبير عن جينات DAP في مجموعات الحمض النووي الريبي غير متعددة الجذور ومتعددة الجذور المقاسة وتقدير محتوى الحمض النووي الريبي في ظل ظروف الخسارة النسبية. باستخدام محتوى الحمض النووي الريبي الطبيعي ، احسب نسبة الحمض النووي الريبي في البوليسومات.

النتائج

نمت النوع البري من نبات الأرابيدوبسيس ، Col-0 ، على وسط MS تحت فترة ضوئية 16 ساعة: 8 ساعات. للتحكم ، تم استخدام شتلات عمرها 5 أيام بدون معالجة الإجهاد الحراري. خضعت مجموعة الإجهاد الحراري لمدة ساعة واحدة من المعالجة الحرارية عند 40 درجة مئوية في حمام مائي مسخن مسبقا ، بينما ?...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول طريقة مباشرة وموحدة لقياس كفاءة ترجمة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. تتمثل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في ضمان استقرار الحمض النووي الريبي من خلال الطرد المركزي الثانوي واستخراج كاشف استخراج الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى التحضير الدقيق لتدرج ?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر خدمات البحث التقني لأجهزة الطرد المركزي الفائقة من شركة Technology Commons في كلية علوم الحياة ومركز الأجهزة برعاية وزارة العلوم والتكنولوجيا ، جامعة تايوان الوطنية (تايوان). كما نشكر Yu-Ling Liang على الدعم الفني ، وأعضاء مختبر Cheng على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج أينشتاين لزمالة الباحث الشاب من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان بموجب منحة رقم. NSTC 113-2636-B-002-007 إلى M.-C.C. تعترف M.-C.C. بالدعم المالي من جامعة تايوان الوطنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf tubeLabcon3012-870-000-9RNA extraction
13.2 mL centrifuge tubeBeckman Coulter331372ultracentrifugation
Bromophenol blueHoneywell32712Polysome profile
ChloroformHoneywell32211RNA extraction
Cycloheximide (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758RNA extraction
EthanolSigma-Aldrich32221RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control KitInvitrogen900433Normalization
GlycerolHoneywell15523Normalization
HeparinSigma-AldrichSI-H3149Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kitVazymeR323-01Normalization
KClJ.T.Baker 3040-01Polysome profile
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Polysome profile
MS basal mediumPhytoM524Plant culture
Peak Chart Syringe PumpBrandelSYN4007LSPolysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)Sigma-AldrichP2393Polysome profile
RNasinPromegaN251BPolysome profile
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Polysome profile
SucroseSigma-AldrichS5391Polysome profile
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalization
TRI reagentMRCTR118RNA extraction
Tris-HClJ.T.Baker 4109-06Polysome profile
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100Kultracentrifugation
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Polysome profile

References

  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of translational control. J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).
  3. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706 (2012).
  4. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  5. Dennis, M. D., Browning, K. S. Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes. J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).
  6. Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).
  7. Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings. Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).
  8. Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3467 (2024).
  9. Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis. Mol Sys Biol. 8 (1), 566 (2012).
  10. Des Marais, D. L., Juenger, T. E. Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance. Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).
  11. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).
  12. Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. Metabolomics for plant stress response. Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).
  13. Sun, M., et al. Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing. BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).
  14. Wasternack, C. Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects. Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).
  15. Chen, T., et al. Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein. Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).
  16. Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eabm7863 (2022).
  17. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  18. Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. Plant stress granules: trends and beyond. Front Plant Sci. 12, 722643 (2021).
  19. Hamada, T., et al. Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis. J Cell Sci. 131 (16), jcs216051 (2018).
  20. Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants. Plants. 9 (9), 1122 (2020).
  21. Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming. Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).
  22. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  23. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. J Vis Exp. (87), e51164 (2014).
  24. Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).
  25. Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals. Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).
  26. Van den Broeck, L., et al. From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress. Mol Sys Biol. 13 (12), 961 (2017).
  27. Dieterich, D. C., et al. detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging. Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).
  28. Zhang, J., et al. Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Acad Press. 588, 41-59 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

QRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved