التلاعب بالقوى الميكانيكية في قلب الزرد النامي باستخدام الخرز المغناطيسي

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة لتطعيم حبة مغناطيسية في قلب سمكة الزرد النامية من خلال الجراحة المجهرية ، مما يتيح التلاعب بالقوى الميكانيكية في الجسم الحي وتحفيز تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي في خلايا الشغاف.

Abstract

توفر القوى الميكانيكية باستمرار التغذية الراجعة للبرامج المورفولوجية لصمام القلب. في سمك الزرد ، يعتمد نمو صمام القلب على تقلص القلب والمحفزات الجسدية الناتجة عن القلب النابض. تظهر ديناميكا الدم داخل القلب ، مدفوعة بتدفق الدم ، كمعلومات أساسية تشكل تطور القلب الجنيني. هنا ، نصف طريقة فعالة لمعالجة القوى الميكانيكية في الجسم الحي عن طريق تطعيم حبة مغناطيسية قطرها 30 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر في تجويف القلب. يتم إدخال الخرزة من خلال الجراحة المجهرية في اليرقات المخدرة دون الإخلال بوظيفة القلب وتمكن من التغيير الاصطناعي للظروف الحدودية ، وبالتالي تعديل قوى التدفق في النظام. نتيجة لذلك ، يؤدي وجود الخرزة إلى تضخيم القوى الميكانيكية التي تعاني منها خلايا الشغاف ويمكن أن يؤدي مباشرة إلى تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي. يسهل هذا النهج التحقيق في مسارات النقل الميكانيكي التي تحكم نمو القلب ويمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول دور القوى الميكانيكية في تكوين صمام القلب.

Introduction

منذ تقديمه في أواخر السبعينيات¹⁹⁷⁰ ، ظهر الزرد (Danio rerio) كنظام نموذجي قوي لدراسة تعقيدات نمو القلب واضطرابات القلب الخلقية. على عكس معظم الفقاريات ، بما في ذلك أجنة الفئران والكتاكيت ، التي تعتمد على نظام القلب والأوعية الدموية الوظيفي ولا يمكنها البقاء على قيد الحياة من عيوب القلب المبكرة ، توفر أسماك الزرد ميزة فريدة من خلال تمكين التحقيق في الأنماط الظاهرية الشديدة للقلب. ويرجع ذلك إلى صغر حجمها ، مما يسهل إمداد الأكسجين الكافي من خلال الانتشار السلبي ، مما يسمح بالبقاء على قيد الحياة حتى في حالة عدم وجود تقلص القلب والدورة الدموية النشطة^2،3

Protocol

تلتزم إجراءات العمل مع أجنة أسماك الزرد الموضحة في هذا البروتوكول بالتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU وإرشادات وزارة الداخلية بموجب ترخيص المشروع PP6020928.

1. الحصول على أجنة الزرد لتطعيم الخرز

1. اعبر خط سمك الزرد ذي الصلة وقم بزراعة الأجنة في وسط دانيو عند 28.5 درجة مئوية. لمزيد من الإرشادات التفصيلية حول عبور خطوط أسماك الزرد ، راجع قاعدة بيانات تعليم العلوم JoVE²⁷.
2. عالج الأجنة باستخدام 1-phenyl-2-thiourea (PTU) من 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لمنع تكوين الصبغة ، باستخدام تركيز 0.003٪ PTU في وسط دانيو.
3. إذا كنت تستخدم خطا يحمل علامة فلورية ، فق....

النتائج

تظهر أمثلة على تطعيم الخرزة الناجح في الشكل 3 والفيديو 3 والفيديو 4. تم وضع الخرزة المغناطيسية بشكل صحيح داخل أذين قلب الزرد ، مما يسمح بتدفق الدم دون عائق وعدم ملاحظة النزيف. بالإضافة إلى ذلك ، حافظت جدران القلب على سلامتها الهيكلية دون ?.......

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

تركيب أجنة الزرد

كمية الاغاروز المستخدمة لتركيب الأجنة مهمة. يجب ألا تكون القبة المتكونة كبيرة بشكل مفرط ، لأن هذا يمكن أن يعيق التلاعب بالخرزة من السطح إلى ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.