JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الطريقة التحليلية MEDUSA لتحديد التأثير التنظيمي للوفاة لكل ضربة قاضية جينية. يتضمن إرشادات حول تحديد الظروف التجريبية التي تعمل على تحسين الحساسية وبرنامج تعليمي خطوة بخطوة حول إجراء التحليل.

Abstract

يمكن استخدام الفحص المنهجي للاضطرابات الجينية في اكتساب أو فقدان الوظيفة لتوصيف التبعيات الجينية وآليات التنظيم لأي عملية خلوية ذات أهمية. تتضمن هذه التجارب عادة التنميط من مجموعة من الاضطرابات الجينية المفردة وكيف يؤثر كل اضطراب جيني على لياقة الخلية النسبية. عند تطبيقها في سياق دراسات فعالية الأدوية ، والتي غالبا ما تسمى التنميط الكيميائي الجيني ، يجب أن تكون هذه الأساليب فعالة في تحديد آليات عمل الدواء. لسوء الحظ ، فإن دراسات التنميط الكيميائي الجيني القائمة على اللياقة البدنية غير فعالة في تحديد جميع مكونات الاستجابة للأدوية. على سبيل المثال ، تفشل هذه الدراسات عموما في تحديد الجينات التي تنظم موت الخلايا الناجم عن الأدوية. تساهم العديد من القضايا في حجب تنظيم الوفاة في الشاشات القائمة على اللياقة البدنية ، بما في ذلك الآثار المربكة لتباين معدل الانتشار ، والتباين في التنسيق الناجم عن الأدوية بين النمو والموت ، وفي بعض الحالات ، عدم القدرة على فصل الحمض النووي عن الخلايا الحية والميتة. MEDUSA هي طريقة تحليلية لتحديد الجينات المنظمة للموت في بيانات التنميط الكيميائي الجيني التقليدية. إنه يعمل باستخدام المحاكاة الحسابية لتقدير معدلات النمو والوفيات التي أنشأت ملف تعريف لياقة ملحوظة بدلا من تسجيل اللياقة البدنية نفسها. يعتمد الاستخدام الفعال للطريقة على التحليل الأمثل للظروف التجريبية ، بما في ذلك جرعة الدواء ، وحجم السكان المبتدئين ، وطول الفحص. ستصف هذه المخطوطة كيفية إعداد دراسة التنميط الكيميائي الجيني للتحليل المستند إلى MEDUSA ، وسنوضح كيفية استخدام الطريقة لتحديد معدلات الوفيات في بيانات التنميط الكيميائي والجيني.

Introduction

في التنميط الكيميائي الجيني ، يتم استخدام الاضطرابات الجينية المنهجية لفهم مساهمة كل جين في استجابة دواء معينة1،2،3. هذه التجارب ذات قيمة ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة حول استجابات الأدوية ، بما في ذلك الهدف الملزم للدواء وآليات تدفق / تدفق الأدوية. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التجارب يتم إجراؤها عادة بطريقة مجمعة تقيم جميع الجينات في وقت واحد ، فإن توليد رؤى ميكانيكية من بيانات التنميط الكيميائي الجيني قد يكون أمرا صعبا.

تميل آليات التحكم والتبعيات الجينية لموت الخلايا الناجم عن الأدوية إلى أن تكون صعبة في حل بيانات التنميط الكيميائي الجيني. هناك عدة أسباب لهذه المشكلة ، ولكن العديد منها ينبع من تأثيرات التباين في تكاثرالخلايا 4. على سبيل المثال ، نظرا لأن الخلايا تتكاثر بشكل كبير ، فإن تأثير الاضطراب الجيني على معدل الانتشار له تأثير أكبر على حجم السكان من تغيير معدلات موت الخلايا. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه الحساسية المتحيزة تتفاقم بمرور الوقت ولأن هذه التجارب تجرى عادة على مدى عدة أسابيع ، فإن معظم الدراسات محسنة لتكون شديدة الحساسية لعيوب التكاثر وغير حساسة بشكل أساسي للتغيرات في موت الخلايا الناجم عن المخدرات. تشمل القضايا الأخرى المتعلقة بالانتشار التنسيق المتنوع بين الانتشار والموت (على سبيل المثال ، مدى سرعة نمو كل استنساخ أثناء الموت أيضا ، وهل يختلف هذا بين الاضطرابات الجينية) والاختلافات في معدلات الانتشار لكل استنساخ في غياب الدواء ، مما يغير العدد المتوقع من الخلايا التي كان يجب / كان من الممكن استردادها إذا لم يكن الدواء فعالا. خلاصة القول هي أن تجارب التنميط الكيميائي الجيني تسجل بشكل عام تأثير الاضطرابات الجينية باستخدام قياسات تتناسب مع أحجام السكان النسبية ، ومقارنة السكان المعالجين وغير المعالجين. نظرا لأن حجم السكان هو نتاج كل من نمو الخلايا ومعدلات موت الخلايا ، من منظور موت الخلايا ، يمثل الانتشار تأثيرا مربكا.

لمعالجة هذه المشكلات ، أنشأنا طريقة لتقييم الوفاة باستخدام نهج المحاكاة (MEDUSA) 5. يعمل MEDUSA من خلال تفسير بيانات الحجم النسبي للسكان المرصودة من خلال عدسة المحاكاة الحسابية لاستنتاج مزيج من معدلات النمو والوفيات الناجمة عن الأدوية التي ولدت استجابة الدواء المرصودة لكل استنساخ جيني. تشير البيانات السابقة إلى أن الطريقة يمكن أن تستنتج بدقة كيف تؤثر الاضطرابات الجينية على معدل الوفيات الناجم عن الدواء ، لكن دقة هذه الطريقة تعتمد على فهم مفصل لكيفية تنسيق تكاثر الخلايا وموت الخلايا بواسطة الدواء وكيف تختلف هذه المعدلات بمرور الوقت5،6. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الاستدلالات المستندة إلى MEDUSA اختبار دواء بجرعة تسبب نفوق الخلايا بشكل كبير. الأهم من ذلك ، أن ظروف التخدير هذه تخلق مخاوف إضافية بشأن أحجام السكان الأولية وأطوال الفحص ، والتي يجب أخذها في الاعتبار بعناية وتحسينها. في هذا البروتوكول ، نصف كيفية إعداد دراسة التنميط الكيميائي والوراثي للتحليل المستند إلى MEDUSA وتقديم استخدام مفصل لهذه الطريقة التحليلية. الهدف العام ل MEDUSA هو تحديد كيفية تأثير كل حذف جيني على معدلات النمو والوفيات الناجمة عن الأدوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحسين جرعة الدواء للحث على موت الخلايا

ملاحظة: البروتوكول أدناه مخصص لتحسين مجموعة واحدة من خط الخلايا والدواء والجرعة باستخدام اختبار FLICK 7,8. تصف بيانات المثال لهذا البروتوكول تحسين وفحص 5 ميكرومولار إيتوبوسيد في خلايا U2OS ، ولكن يمكن تطبيق نفس خطوات التحسين على أي مجموعة أخرى مرغوبة من خط الخلية والمخدرات / الجرعة. لا يتطلب هذا البروتوكول جمع الخلايا الميتة أو تحليلها. يمكن استخدام هذا البروتوكول لثقافات التعليق ، بشرط إزالة الخلايا الميتة. بالنسبة لثقافات التعليق ، يمكن فرز / فصل الخلايا الميتة باستخدام علامة البقاء أو علامة خاصة بموت الخلايا.

  1. قبل إجراء اختبار FLICK ، قم بتحسين رقم الخلية ، ونفاذية Triton-X ، وتركيز SYTOX ، وإعدادات اكتساب قارئ اللوحة باستخدام البروتوكول التفصيلي الموضح في8.
  2. خلايا صفيحة في ألواح سوداء ذات قاع شفاف 96 بئر. تتراوح كثافة البذر النموذجية بين 1500 و 5000 خلية لكل بئر ، ويجب تحسين هذا الرقم لكل خط خلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة لمدة 16-24 ساعة.
  3. تحضير التخفيفات الدوائية في الوسائط التي تحتوي على تركيز SYTOX الذي تم تحديده على أنه الأمثل في الخطوة (1.1). عادة ما يتم اختبار الأدوية عبر سلسلة تخفيف لوغاريتمية تحتوي على 8-12 جرعة ذات صلة بيولوجيا أو سريريا.
    ملاحظة: يمكن لبعض الأدوية أن تنبعث منها مضان بنفس الطول الموجي مثل SYTOX ، مما يجعل القياس الكمي باستخدام هذا الفحص مستحيلا. في مثل هذه الحالات ، قد يكون استخدام متغيرات SYTOX التي تنبعث منها مضان بأطوال موجية مختلفة مفيدا. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لهذا الاختبار تقييم التفاعل مع الأدوية التي تؤثر على مضان SYTOX أو تمنع SYTOX من الارتباط بالحمض النووي.
  4. قم بتحليل لوحة واحدة (T0) باستخدام Triton-X بالتركيز الأمثل في الخطوة (1.1). بعد تحلل الخلية ، استخدم قارئ لوحة لقياس مضان SYTOX وتحديد إجمالي عدد خلية البداية بناء على العلاقة الراسخة تجريبيا بين التألق وعدد الخلية (انظر بروتوكول FLICK7،8).
  5. قم بقياس تألق SYTOX في اللوحات التجريبية عند T0 باستخدام قارئ اللوحة ، مع تحسين الإعدادات في الخطوة (1.1).
  6. راقب إشارة SYTOX بمرور الوقت لمدة ثلاثة أيام. لتقييد البيانات الحركية الناتجة ، استخدم ثلاث نقاط زمنية على الأقل يوميا ، كل منها 4 ساعات.
    ملاحظة: يقيم هذا البروتوكول موت الخلايا ونموها على مدار 3 أيام. عادة ما تكون هذه المدة الزمنية كافية للأدوية المسببة للوفاة. ومع ذلك ، يمكن تقصير الاختبار أو إطالة أمده لاستيعاب الأدوية ذات حركية الموت البديلة.
  7. بعد النقطة الزمنية النهائية ، قم بتحليل اللوحة (الصفائح) التجريبية باستخدام Triton-X لتحديد الحجم النهائي للسكان لكل حالة.
  8. احسب الجدوى الكسرية (FV) وقم بملاءمة بيانات نقطة النهاية مع منحنيات الجرعة، كما هو موضح في بروتوكول FLICK 7,8.
  9. تحديد جرعات الدواء التي تسبب ما يقرب من 50٪ من موت الخلايا من خلال تقييم منحنيات جرعة FV.
    ملاحظة: يتطلب تحديد الخلايا الميتة بواسطة SYTOX تمزق غشاء البلازما وانهيار الغلاف النووي. تحتاج هذه الأغشية إلى صيانة مستمرة ، لذلك سيحدد SYTOX الخلايا الميتة بغض النظر عن آلية موت الخلايا التي يسببها الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه العمليات لا تحدث بنفس الفعالية لجميع أشكال موت الخلايا ، مما قد يؤثر على قدرة SYTOX على قياس الخلايا الميتة بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، ستنتج آليات موت الخلايا المختلفة جثثا خلوية ذات ثبات مختلف. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن جميع أشكال موت الخلايا التي تم اختبارها حتى الآن تؤدي إلى الحمض النووي المرتبط ب SYTOX (إما داخل نواة نفاذة أو في وسط زراعة الخلايا). تكون إشارة SYTOX هذه مستقرة بشكل عام خلال اختبار مدته 72 ساعة ولكن يمكن مراقبتها عن طريق تقييم العدد الإجمالي للخلية في بداية ونهاية الفحص.

2. اختيار طول الفحص

  1. باستخدام بيانات FLICK التي تم جمعها في الخطوة 1 ، احسب الكسر المميت لكل حالة (LF) بمرور الوقت كما هو موضح في بروتوكول FLICK7،8. قم بتركيب بيانات LF الحركية على نموذج الموت الأسي المتأخر (LED) ، كما هو موضحسابقا 9.
  2. ارسم LF بمرور الوقت لكل جرعة مميتة محددة في الخطوة 1. حدد الجرعة والنقطة الزمنية التي تنتج ~ 50٪ LF.
    ملاحظة: جزء مميت من ~ 50٪ يثري إشارات قوية خاصة بالموت في بيانات فحص كريسبر مع ترك ما يكفي من الخلايا الحية وراءه للحفاظ على تمثيل المكتبة5. ومع ذلك ، فإن بعض الأدوية ستكون مقيدة بأسبقية الأدبيات أو مجموعة ضيقة من الجرعات التي تحفز نمطا ظاهريا محددا مرغوبا. إذا كانت الجرعة مقيدة ، فيجب تقصير نقطة نهاية الفحص أو تمديدها لضمان وصول الجرعة المطلوبة إلى ~ 50٪ LF. إذا لم يكن من الممكن أن تكون الفتك بنسبة 50٪ ، فقد يلزم زيادة حجم السكان المبتدئين.

3. تحديد حجم السكان المبدئي

  1. حدد جرعة الدواء المطلوبة لتحسين الفحص بشكل أكبر بناء على التحسين أعلاه.
  2. خلايا الألواح على أطباق 10 سم في وسائط كاملة. يجب أن تكون كل حالة مطلية بثلاث نسخ فنية وتكرارات بيولوجية كافية بحيث يمكن حساب الخلايا كل 12-24 ساعة لطول الشاشة ، بما في ذلك T = 0 النقطة الزمنية.
    ملاحظة: قد تحتاج أرقام الخلايا المطلية إلى التحسين بشكل منفصل للخلايا غير المعالجة والمعالجة ، مع الأخذ في الاعتبار صافي معدل النمو السكاني وحجم الخلية. يجب أن تكون الخلايا مطلية بشكل عام بكثافات تؤدي إلى التقاء لا يضر بصحة الخلية عند نقطة نهاية الفحص (على سبيل المثال ، للعديد من أنواع الخلايا < 80٪ ملتقية). يمكن أيضا إعادة طلاء الخلايا المعالجة وغير المعالجة أثناء الشاشة ، إذا لزم الأمر ، طالما تم الحفاظ على تمثيل المكتبة.
  3. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. أضف الدواء بالتركيز المطلوب إلى لوحات العلاج. في موازاة ذلك ، قم بحصاد الخلايا من 3 لوحات غير معالجة وحساب عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بتلطيخ الخلايا الميتة باللون الأزرق (أو صبغة قابلة للحياة مماثلة) للتأكد من حص الخلايا الحية فقط. تحدد هذه البيانات عدد الخلايا عند النقطة الزمنية T = 0.
  5. بعد 12-24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا من 3 لوحات غير معالجة و 3 لوحات معالجة واحسب عدد الخلايا الحية. كرر الحصاد حتى يتم الوصول إلى نقطة نهاية المقياس. لفهم حركية المخدرات وموت الخلايا بشكل كامل ، يوصى بمراقبة الخلايا الحية لمدة 24-48 ساعة بعد النقطة الزمنية المحددة في الخطوة (2.2).
  6. تصور التغييرات في الجدوى عن طريق رسم حجم السكان (المحور y) بمرور الوقت (المحور x).
    ملاحظة: استنادا إلى الحد الأقصى لعدد الخلية المرصود والحجم النهائي للمجموعة ، يمكن إجراء تقدير تقريبي للجزء المميت عند نقطة النهاية. يجب مقارنة ذلك ببيانات الجدوى الجزئية والكسر المميت التي تم إنشاؤها باستخدام مقايسة FLICK (الخطوة 1.9 والخطوة 2.2) لضمان تحقيق المقدار المتوقع لموت الخلايا.
  7. حدد النقطة الزمنية بأصغر حجم للسكان. اعتمادا على مقدار النمو الذي يحدث في وجود الدواء ، سيكون هذا إما في بداية أو نهاية شاشة كريسبر.
  8. حدد حجم السكان الأولي. تأكد من تحسين عدد الخلايا المبدئي للحفاظ على تغطية مكتبة 500x-1000x على الأقل عبر الشاشة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، تحتوي مكتبة TKOv3 على 70,948 sgRNAs. لتمثيل هذه المكتبة بتغطية 500 ضعف، يجب الحفاظ على ما لا يقل عن 35,474,000 خلية لكل تكرار لكل شرط في جميع أنحاء المقايس. غالبا ما يصادف حجم عنق الزجاجة هذا في بداية الفحص أو بعد التربسين وتقليل أخذ العينات للحالات غير المعالجة أو التكاثرية. في المقابل ، غالبا ما يتم تحديد حجم مجموعة عنق الزجاجة من خلال حجم السكان عند نقطة نهاية الفحص للعلاجات الدوائية التي تحفز فتكا كبيرا.
  9. إذا رغبت في ذلك ، كرر التحسين أعلاه على اللوحات التي سيتم استخدامها لشاشة كريسبر (على سبيل المثال ، لوحات 15 سم) للتأكد من أن فعالية الدواء تتناسب بشكل صحيح.

4. أداء شاشة كريسبر

ملاحظة: يمكن فحص الخلايا باستخدام طرق فحص كريسبر المعمول بها بعد تحسين جرعة الدواء وطول الفحص. يمكن استخدام البروتوكولات المعمول بها ، مثل بروتوكول فحص TKO من مختبر Moffat10،11 ، لإعداد مكتبة فحص CRISPR ، وإنتاج الفيروسات ، وإجراء شاشة CRISPR ، وإعداد المكتبات للتسلسل (الشكل 1A-B). يصف البروتوكول أدناه الخطوات الخاصة بتحليل MEDUSA ، والذي يجب إجراؤه على البيانات على مستوى العد بعد التسلسل.

  1. احسب تغييرات الطية التي تمت ملاحظتها تجريبيا لكل sgRNA (الشكل 1C) كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإنشاء جدول أعداد على مستوى sgRNA لإعداد بيانات التسلسل للتحليل. تقليم مكتبات تسلسل وتعيين الخرائط باستخدام المسارات القياسية، كما هو موضح5،12.
    2. تطبيع عمق مكتبة التسلسل. تطبيع المكتبات إما يدويا أو باستخدام وظائف مضمنة مثل تلك الموجودة في DESeq2 ، كما في 5،12. قم بإجراء التسوية مقابل جميع الأدلة أو باستخدام توزيع الأدلة غير المستهدفة.
    3. قم بتعيين sgRNAs غير المستهدفة بشكل عشوائي للجينات غير المستهدفة. على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي المكتبة التي تحتوي على أربعة sgRNAs لكل جين على أربعة sgRNAs غير مستهدفة لكل جين غير مستهدف.
    4. لكل مقارنة فائدة (غير معالج / T0 و / أو معالج / غير معالج) ، احسب log2 (تغيير الطية). يوصى بحساب ذلك باستخدام ملاءمة بارامترية في DESeq2 ، على الرغم من أنه يمكن أيضا إجراء حساب يدوي لتغيير الطية.
    5. تقليم sgRNAs بعدد قليل من التهم. ستعتمد استراتيجية التشذيب الصحيحة على مستوى الضوضاء بين التكرارات وكيف يختلف ذلك على مدار العدد. ستختلف هذه الميزات اعتمادا على مكتبة كريسبر ، وتختبر عمليات قطع متعددة بالتوازي للحصول على بيانات جديدة. تشمل استراتيجيات القطع الشائعة المستندة إلى سابقة الأدبيات إزالة أدنى 5٪ من الأدلة أو إزالة الأدلة تحت بعض العتبة الاسمية13.
  2. حدد تأثير كل ضربة قاضية من الجين على معدل النمو كما هو موضح أدناه.
    1. احسب صافي معدل النمو السكاني (NPG) للخلايا غير المعالجة (أي وقت مضاعفة السكان المرصود ، الشكل 1 د). يمكن استخلاص هذا من بيانات FLICK في الخطوة 1 ، أو عدد الخلايا الحية بمرور الوقت في الخطوة 3 ، أو القياسات التجريبية السابقة لخط الخلية ذي الاهتمام.
    2. يتطلب MEDUSA ثلاثة معلمات لنمذجة الحالة غير المعالجة: NPG: صافي معدل النمو السكاني ، بالمضاعفة / ساعة ؛ Tstart: نقطة البداية ، بالساعة. يتم تعيين هذا إلى الإعداد الافتراضي 0 ؛ تميلإلى أنت: النقطة الزمنية النهائية للحالة غير المعالجة ، في ح.
    3. محاكاة جميع الاضطرابات المحتملة لمعدل NPG. استخدم حلقة for لتقييم نطاق من قيم NPG المحتملة. لكل معدل نمو نسبي، احسب log2 (تغيير الطية) الذي سيتم ملاحظته عند نقطة نهاية المقايسة.
    4. لكل sgRNA تجريبي في الخطوة 4.1.5 ، حدد تغيير الطية المحاكي الأقرب إلى البيانات المرصودة. قم بتعيين معدل النمو النسبي الذي أدى إلى تغيير الطية المحاكي إلى sgRNA هذا.
  3. توصيف التنسيق بين النمو والموت كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يمكن استخراج المعلمات المطلوبة ل MEDUSA من بيانات نمط FLICK عند تحليلها باستخدام طريقة تحليل GRADE14. يمكن استخدام البيانات من (1) و (2) لهذا الغرض ، أو يمكن إجراء تجربة معلمات إضافية.
    1. يستخدم MEDUSA أربعة معلمات لتوصيف التنسيق بين النمو والوفاة في وجود الدواء:دواء GR 1: معدل النمو الناجم عن الأدوية قبل ظهور الوفاة ، بالمضاعفة / ساعة. DO: وقت بداية الموت ، في h. دواء الموارد الوراثية 2: معدل النمو الناجم عن المخدرات بعد ظهور الوفاة، بالمضاعفات/ساعة؛ عقار DR: معدل الوفيات الناجم عن المخدرات ، بوحدات الكسر المميت / ساعة. لمعلمة DO ، استخدم حركية LF. استخرج وقت بداية الموت من مقاس LED.
  4. تحديددواء DR باستخدام حركية LF. تحديد متوسط معدل الوفيات بقسمة LF النهائي على الوقت التالي لبداية الوفاة (بالساعة).
  5. تحديددواء الموارد الوراثية 1 من بيانات عد الخلايا الحية في الخطوة 3. قبل ظهور الوفاة ، حدد معدل النمو الناجم عن الدواء عن طريق ملاءمة البيانات في معادلة أسية بسيطة.
    1. تحديددواء الموارد الوراثية2 باستخدام مجموعة من المعطيات المستمدة من الخطوة 3 والمخدرات من الدرجة14. احسب وارسم GRADE لجرعة الدواء المحددة على مخطط GRADE. إذا كانت GRADE = 0، افترض أندواء GR2 يساوي 0؛ إذا كانت الدرجة > 0، فاستخدم GRADE لتحديد متوسط معدل نمو السكان. واستنادا إلى القيمة المحددة تجريبيالعقار الموارد الوراثية1، حدد قيمةدواء الموارد الوراثية2 التي ينتج عنها متوسط معدل النمو المرصود.
      ملاحظة: يمكن استنتاج متوسط معدل النمو الناجم عن الدواء من مخطط GRADE عن طريق حساب المسافة الزوجية بين نقطة البيانات المرصودة (أي زوج من بيانات GR و FV للدواء) وكل نقطة تشكل مساحة GRADE وتحديد أقرب نقطة. للحصول على تعليمات مفصلة ، انظر المرجع14. معدلات النمو الناجمة عن الأدوية ومعدلات الوفيات ليست قيما ثابتة لكل دواء وهي خاصة بدواء بجرعة معينة في سياق خلية معين.
  6. قم بإنشاء تغييرات محاكاة للطيات لجميع المجموعات الممكنة لمعدل النمو ومعدل الوفيات كما هو موضح أدناه.
    1. باستخدام التنسيق المحدد تجريبيا لمعدل النمو الناجم عن الأدوية ومعدل الوفيات ، قم ببناء نموذج يحاكي حجم السكان الناجم عن المخدرات بمرور الوقت (الشكل 1 د). يمكن بناء هذا النموذج كوظيفة قطعية تجمع بين مرحلتين مستقلتين من الاستجابة للدواء (وقت ظهور ما قبل وبعد الوفاة).
    2. للحصول على نموذج MEDUSA الكامل ، قم بتضمين هذه المعلمات الثمانية: NPG: صافي معدل النمو السكاني ، في المضاعفات / ساعة ؛ دواء الموارد الوراثية 1: معدل النمو الناجم عن المخدرات قبل بداية الوفاة، بالمضاعفات/ساعة؛ DO: وقت بداية الموت ، في h. دواء الموارد الوراثية 2: معدل النمو الناجم عن المخدرات بعد ظهور الوفاة، بالمضاعفات/ساعة؛ عقار DR: معدل الوفيات الناجم عن المخدرات ، بوحدات الكسر المميت / ساعة ؛ Tstart: نقطة البداية ، بالساعة. يتم تعيين هذا إلى الإعداد الافتراضي 0 ؛ تميلإلى أنت: النقطة الزمنية النهائية للحالة غير المعالجة ، في الساعة ؛ Tendtr: النقطة الزمنية النهائية للحالة المعالجة ، في h.
    3. بالنسبة للنموذج الأساسي ، قم بمحاكاة جميع اضطرابات النمو والوفيات المحتملة. لكل مجموعة ، احسب log2 (تغيير الطية) الذي سيتم ملاحظته.
      ملاحظة: في MEDUSA ، يفترض أن تكون الاضطرابات في معدل النمو متناسبة عبر NPGوعقار الموارد الوراثية 1 وعقار GR 2. على سبيل المثال ، يؤدي انخفاض بنسبة 80٪ في معدل NPG أيضا إلى انخفاض بنسبة 80٪ في معدلات النمو الناجمة عن الأدوية.
  7. استنتج معدل الوفيات لكل ضربة قاضية (الشكل 1D-E) كما هو موضح أدناه.
    1. لكل sgRNA ، قم بتثليث معدل الوفيات الناجم عن الدواء والذي كان من شأنه أن ينتج عنه تغيير الطية الملحوظ. أولا ، استخرج معدل النمو النسبي المحدد في الخطوة (4.2.4).
    2. تحديد معدلاتدواء الموارد الوراثية1ودواء الموارد الوراثية2. تطبيق معدل النمو النسبي من NPG لحساب معدل النمو النسبيلدواء GR 1 /GR 2.
    3. باستخدام القيود المفروضة على NPGوعقار GR 1 وعقار GR 2 ، حدد تغيير الطية المحاكي الأقرب إلى تغيير الطية المرصود لكل sgRNA (معالج / غير معالج). استخدم مزيجا من هذه الملاحظات لحساب معدل الوفيات الناجم عن المخدرات.
  8. احسب معدلات النمو على مستوى الجينات ومعدلات الوفيات كما هو موضح أدناه.
    1. تحديد معدلات مستوى الجينات لكل جين في المكتبة. احسب متوسط كل معدل نمو ومعدل وفيات لجميع sgRNAs المرتبطة بجين معين (عادة 4-10).
    2. لحساب قيم p التجريبية ، قم بتمهيد البيانات على مستوى sgRNA. قم بإجراء تصحيح FDR باستخدام إجراء Benjamini-Hochberg.
      ملاحظة: يتم تضمين التعليمات التكميلية ، بالإضافة إلى عينة البيانات لتحليل بيانات فحص CRISPR باستخدام MEDUSA ، في مستودع GitHub الخاص بنا (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، استكشفنا التبعيات الجينية للموت الناجم عن الإيتوبوسيد في خلايا U2OS. إيتوبوسيد هو علاج كيميائي شائع الاستخدام لإتلاف الحمض النووي15. تم إجراء تجربة التنميط الكيميائي الجيني هذه باستخدام مكتبة GeCKOv216 في Cas9 التي تعبر عن خل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول ، نصف استخدام طريقة MEDUSA التحليلية لقياس بيانات التنميط الكيميائي الجيني لتسجيل كيفية تغيير الاضطرابات الجينية لمعدلات النمو والوفيات الناجمة عن الأدوية. نظرا لأن الناتج الأساسي لتجربة التنميط الكيميائي الجيني مرتبط بحجم السكان ، وليس المعدلات ، يتم ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبر لي ، في الماضي والحاضر ، على مساهماتهم في وجهة نظر مختبرنا حول تقييم استجابات الأدوية. تم دعم هذا العمل من خلال تمويل MJL و MEH من المعاهد الوطنية للصحة (U01CA265709 و R21CA294000 و R35GM152194 إلى MJL ، و F31CA268847 إلى MEH) ، تمويل MJL من مؤسسة Jayne Koskinas Ted Giovanis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012924For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012925For growing cells and optimizing population size
DESeq2R Packagev1.44.0For calculating fold-change
DMEMCorning10017CVFor seeding and drugging cells
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCFor seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher ScientificFB012932For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateGreiner655090For seeding and drugging cells
MATLABMathworks R2024aFor performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence readerTecanSparkFor dead cell measurements
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR libraryAddgene125517For performing CRISPR screen
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APFor permeabilizing cells
Trypan blue CorningMT25900CIFor measure live/dead cells

References

  1. Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
  2. Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
  3. Colic, M., Hart, T. Common computational tools for analyzing CRISPR screens. Emerg Top Life Sci. 5 (6), 779-788 (2021).
  4. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  5. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  6. Leylek, O., Honeywell, M. E., Lee, M. J., Hemann, M. T., Ozcan, G. Functional genomics reveals an off-target dependency of drug synergy in gastric cancer therapy. Gastric Cancer. 27 (6), 1201-1219 (2024).
  7. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  8. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  9. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic quantification of population cell death kinetics in mammalian cells. Cell Syst. 4 (6), 600-610.e6 (2017).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and design of genome-wide CRISPR/SpCas9 knockout screens. G3. 3 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  12. Cruz-Gordillo, P., Honeywell, M. E., Harper, N. W., Leete, T., Lee, M. J. ELP-dependent expression of MCL1 promotes resistance to EGFR inhibition in triple-negative breast cancer cells. Sci Signal. 13 (658), eabb9820(2020).
  13. Parnas, O., et al. A Genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell. 162 (3), 675-686 (2015).
  14. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An integrated analysis of population growth and cell death reveals drug-specific and cancer subtype-specific response profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  15. Montecucco, A., Biamonti, G. Cellular response to etoposide treatment. Cancer Lett. 252 (1), 9-18 (2007).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Colic, M., et al. Identifying chemogenetic interactions from CRISPR screens with drugZ. Genome Med. 11 (1), 52(2019).
  18. Olivieri, M., Durocher, D. Genome-scale chemogenomic CRISPR screens in human cells using the TKOv3 library. STAR Protoc. 2 (1), 100321(2021).
  19. Cai, X., Stringer, J. M., Zerafa, N., Carroll, J., Hutt, K. J. Xrcc5/Ku80 is required for the repair of DNA damage in fully grown meiotically arrested mammalian oocytes. Cell Death Dis. 14 (7), 397(2023).
  20. Colville, A., et al. Death-seq identifies regulators of cell death and senolytic therapies. Cell Metab. 35 (10), 1814-1829.e6 (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

216

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved