وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Summary

في هذا الفيديو ، فإننا نبين كيفية تسمية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) مع كلوريد المنغنيز (MnCl ₂) التي يمكن أن تدخل الخلايا عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات عندما كانت الخلايا النشطة بيولوجيا. بالإضافة إلى ذلك ، وتبين لنا من استخدام MnCl ₂ الخلوية وكيل النقيض التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد الجدوى من المختبر في hESC.

Abstract

وقد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) القدرة على استعادة عضلة القلب المصاب. وقد برز التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) باعتبارها واحدة من طرائق التصوير السائد لتقييم ترميم عضلة القلب المصاب. وعلاوة على ذلك ، تم توظيف وكلاء العلامات السابقين الحية ، مثل الحديد وأكسيد النانوية ، لتعقب وتوطين الخلايا الجذعية المزروعة. ومع ذلك ، فإن هذا الأسلوب لا مراقبة الممتلكات الأساسية البيولوجيا الخلوية بشأن الجدوى من الخلايا المزروعة. لقد كان من المعروف أن كلوريد المنغنيز (MnCl ₂₎ يدخل الخلايا عبر الجهد بوابات الكالسيوم (كا ^{2 +)} قنوات عندما كانت الخلايا النشطة بيولوجيا ، ويتراكم intracellularly لتوليد تأثير تقصير T ^1. لذا ، نقترح أن المنغنيز الموجهة التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن تكون مفيدة لمراقبة سلامة الخلية بعد زرع hESC في عضلة القلب.

في هذا الفيديو ، وسوف نعرض كيفية تسمية hESC مع MnCl ₍₂₎ وكيف يمكن رؤيتها بوضوح تلك الخلايا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في المختبر. في الوقت نفسه ، والنشاط البيولوجي للكا ^{2 +} القنوات سوف يتم استخدام التضمين سواء كا ^{2 +} قناة ناهض وخصم لتقييم التغيرات المصاحبة إشارة.

Protocol

المنغنيز وصفها من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

1. يعرض للتريبسين ينبع الجنينية البشرية التي تم تربيتها في التغذية الخالية من الشروط لمدة 5 دقائق. تحييد وسائل الإعلام عن طريق إضافة التربسين الثقافة.
2. تدور باستمرار الخلايا الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. بعد إعادة تعليق الخلية بيليه ، حساب عدد الخلايا التي تلون التريبان الأزرق. استنادا إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها ، وتقسيم الخلايا إلى أربع aliquots 3 ملايين الخلايا في أنابيب مخروطية. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي.
3. قبل البدء في وضع العلامات والمنغنيز ، ويحل كلوريد المنغنيز الطازجة بنسبة 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم لجعل 0.1mM محلول كلوريد المنغنيز.
4. وبغية مراقبة نشاط قناة الكالسيوم ، أعدت أربع عينات. العينة الأولى سيطرتنا الذي يحتوي على الخلايا المحتضنة في 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم وحدها. والنموذج الثاني يحتوي على خلايا المحتضنة في MnCl 0.1 ملم _2. نموذج 3 و 4 تحتوي على خلايا المحتضنة في MnCl 0.1 ملم ₂ مع 5 ميكرومتر أي من كا ^{2 +} قناة ناهض و (ق)-(-)- خليج K8644 ، أو 250 ميكرومتر من كا ^{2 +} قناة خصم ، فيراباميل. احتضان العينات الأربعة في 37 درجة مئوية ، مع 5 ٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
5. بعد 30 دقيقة ، وتدور باستمرار في 800 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. نضح ثم طاف وغسل الخلايا المسمى مرتين مع برنامج تلفزيوني. بعد غسلها ، وإعادة تعليق كل بيليه في برنامج تلفزيوني مع 200 ميكرولتر ونقل إلى أنابيب PCR. هذه الكريات وعادة ما تكون بيضاء.

الوسم الحديد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

1. مزيج السريرية الصف سلفات بروتامين بالماء المقطر للحصول على محلول المخزون 1 ملغ / مل.
2. في أنبوب يحتوي على وسائل الاعلام الإنسان الخلية الجذعية الجنينية الثقافة ، إضافة ferumoxides عند 100 ميكروغرام / مل تليها إضافة 12 ميكروغرام / مل سلفات بروتامين. مزيج الحل بقوة لمدة خمس دقائق.
3. إضافة إلى حل مختلط كمية متساوية من وسائل الإعلام لتحقيق ثقافة خلية تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل من ferumoxides و 6 ميكروغرام / مل من سلفات بروتامين إلى خلايا التسمية. احتضان خلايا في هذا الحل لمدة 12 ساعة.
4. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ، مع غسل مشاركة تحتوي على الهيبارين 10U/ml حل خارج الخلية المعقدة ferumoxides - سلفات بروتامين. بعد الغسيل ، ويعرض للتريبسين الخلايا للحصول على تعليق خلية واحدة.
5. عدد الخلايا وقسامة في العدد المطلوب من العينات. بعد غسلها ، وإعادة تعليق كل بيليه في برنامج تلفزيوني مع 200 ميكرولتر ونقل إلى أنابيب PCR. ينبغي لهذه الكريات تكون مظلمة برتقالي بني اللون.

أداء الخلوية التصوير بالرنين المغناطيسي

1. جعل الوهمية من أجل تحقيق الاستقرار في الأنابيب التي تحتوي على حبيبات الخلية وأيضا لتجنب الآثار من الهواء المحيط أثناء المسح. للقيام بذلك ، ومزيج من 0.8 ٪ و 1 ٪ آغار من كبريتات النحاس في الماء المقطر ، وجعله ليغلي بواسطة الميكروويف لمدة 5-7 دقائق. تبريد هذا الخليط لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل المسح الضوئي للوصول الى هلام.
2. يتم وضع الأنابيب التي تحتوي على حبيبات الخلية المسمى في الظاهرية للمسح الضوئي. في المختبر يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي الخلوية في التصوير بالرنين المغناطيسي Signa 3T HDX (GE للأنظمة الطبية) باستخدام السريرية لفائف الركبة.
3. فحص خلايا المنغنيز المسمى لكل من العينات الثلاث باستخدام تسلسل صدى تدور : TR ؛ مرة = 800 مللي ثانية التكرار. TE ؛ صدى الوقت = الدنيا ، FOV ؛ مجال الرؤية = 12 X 12 سم ؛ مصفوفة = 256x256 ، NEX 1.
4. فحص الخلايا الحديد المسمى باستخدام سلسلة متدرجة الصدى. نحن نستخدم المعايير التالية لهذا التصوير : TR = 100 مللي ثانية ؛ = 30 درجة زاوية الوجه ؛ ؛ FOV = 12 X 12 سم ؛ مصفوفة = 256 × 256 ، NEX 1 = 10 مللي ثانية TE ، FA.

تحليل نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي

1. تحليل صور المسح بالرنين المغناطيسي في الفترة من 4 عينات مختلفة من الخلايا التي تحمل علامات المنغنيز :
   • نموذج رقم 1 هو سيطرتنا الذي يحتوي على خلايا المحتضنة في 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم وحدها.
   • نموذج رقم 2 يحتوي على خلايا المحتضنة في MnCl 0.1 ملم _2.
   • نموذج رقم 3 يحتوي على خلايا المحتضنة في MnCl 0.1 ملم مع ₂ من 5 ميكرومتر كا ^{2 +} قناة ناهض و (ق)-(-)- خليج K8644.
   • نموذج رقم 4 يحتوي على خلايا المحتضنة في MnCl 0.1 ملم ₂ مع 250 ميكرومتر من كا ^{2 +} قناة خصم ، فيراباميل.
2. كما تنبأ ، والاختلافات في كثافة إشارة من المنغنيز الخلايا المسماة مرئية. مقارنة مع الخلايا المسماة بحتة المنغنيز ، وشدة إشارة يزيد بشكل واضح في وجود قناة الكالسيوم ناهض والنقصان في وجود خصم قناة الكالسيوم. ويتم قياس المنطقة حيث كثافة إشارة زاد عن المنغنيز الخلايا المسمى باستخدام صورة J (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MD ، الولايات المتحدة). يتم استخدام نفس البرنامج لتحليل مجال إشارة خارج الرنين الظلام من الحديد المسمى الخلايا. حجم إشارة مظلمة من الحديد المسمى الخلايا يعتمد على عدد من الخلايا أو عدد جزيئات الحديد الواردة في الخلايا. في هذه الحالة، 1000000 الخلايا تظهر منطقة أصغر من إشارة مظلمة بالمقارنة مع الإشارة من الخلايا ثلاثة ملايين نسمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذه النتائج تشير إلى أن المنغنيز لا يدخل عبر قنوات الكالسيوم الجهد مسور ، ويمكن استخدامها المنغنيز كعامل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتي يمكن أن تظهر أيضا بقاء الخلية. لذا ، نقترح أن المنغنيز الموجهة التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن تكون مفيدة لمراقبة سلامة الخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190