توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Summary

هذا الفيديو يوضح أسلوب microinjection في الغدد التناسلية من ايليجانس جيم لخلق حيوانات معدلة وراثيا.

Abstract

يمكن أن يكون وراثيا ايليجانس انواع معينة بسهولة عن طريق إنشاء microinjection حل DNA البلازميد في ¹ التناسلية. ال DNA البلازميد يتشكل من جديد إلى النموذج concatamers خارج الصبغي التي ورثت ستابلي ، وإن لم يكن بنفس الكفاءة كما الكروموسومات الفعلي ^2. والمورثة ذات الاهتمام المشترك مع حقن علامة an المظهري واضحة ، مثل رول أو GFP - 6 ، للسماح للاختيار من الحيوانات المعدلة وراثيا تحت المجهر تشريح. ويمكن التعبير عن هذا الجين الخارجية من المروج الأصلي للدراسات توطين الخلوية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التحوير المروج مختلف الأنسجة محددة لتقييم دور الجينات في منتج معين أو تلك الخلية الأنسجة. هذه التقنية محركات بكفاءة التعبير الجيني في جميع أنسجة ايليجانس جيم باستثناء الجنين أو أوائل germline ^3. ويستخدم على نطاق واسع من الحيوانات المعدلة وراثيا إنشاء لمجموعة من النماذج التجريبية. هذا الفيديو يوضح الإجراء microinjection لتوليد الديدان المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك ، وصفت اختيار وصيانة خطوط مستقرة جينيا ايليجانس جيم.

Protocol

البناء التعبير البلازميد

مطلوبة البلازميدات اثنين : واحد للانسجة محددة التعبير عن الجينات في المصالح ، والمرتبة الثانية من حيث اختيار علامة التحول.

التجريبية البلازميد

1. حدد المروج التي يعبر عنها في نوع النسيج / خلية من الاهتمام ، على سبيل المثال ، او العصب العضلات الخاصة المروج. إذا كان واحد هو التعبير عن جينات متعددة داخل النسيج نفسه ، ويمكن استخدام شريط المروج البلازميد في النظام عبارة (Invitrogen). هذا النهج يسمح للالإدراج في أي من الجين المصب مصلحة المروج بنسبة ⁴ الاستنساخ تهجيني ^وعموما ، 2-5 كيلو بايت من متواليات المنبع يكفي أن يكون تعبيرا صحيحا ودقيقا.
   
   
2. ويمكن استنساخ [كدنا] من الجينات ذات الاهتمام بطريقتين :
   1. الاستنساخ التقليدية باستخدام إنزيمات التقييد.
   2. عبارة عن الاستنساخ ، هو تضخيم PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل عبارة B ATT تهجيني. هو معاد لأول مرة [كدنا] تضخيم في pDONR201 المانحة لإنشاء ناقلات ناقلات دخول ثم تحولت إلى E. القولونية سلالة DH5a. بعد اختيار recombinants ناجحة وصغيرة من الحمض النووي الإعدادية العزلة ، هو معاد للناقلات دخول ناقلات الوجهة التي تحتوي على مروج لإنشاء التعبير البلازميد. تفاصيل حول الاستنساخ تهجيني تتوفر إما من دليل أو في عبارة Invitrogen كالدويل وآخرون ^5.

اختيار ماركر البلازميد

أمثلة على البلازميدات علامة المعدلة وراثيا تشمل رول - 6 أو استخدام العضلات المروج الجسم الجدار UNC - 54 إلى محرك الفلورسنت بروتين تعبير. هذه علامة البلازميدات عادة ما تكون متاحة من داخل الأوساط البحثية عند الطلب.

Microinjection من ايليجانس جيم

إعداد

1. أداء العزلة الحمض النووي للالبلازميدات اللذين يتم ليتم حقنه. Quantitate منهم وتخلط معا في نسبة 1:1 من كل نانوغرام / 50 ميكرولتر.
   
   
2. إعداد منصات أجار :
   1. جعل الحل agarose 2 ٪ في الماء ، الحرارة أو الميكروويف حتى المنحل.
   2. المبينة عدة تغطي 22 × 50 مم النظارات على الفوق.
   3. باستخدام ماصة باستور ، ضع نقطة من agarose ذاب على الزجاج غطاء واحد ومكان على الفور الزجاج غطاء الثاني على الهبوط بزاوية 90 إلى الأول. تكرار للعديد من النظارات تغطية أخرى. ينبغي أن قطر القرص بالارض من agarose يكون بين 15-20 ملم.
   4. بعد agarose وقد عززت (وهذا يستغرق سوى لحظات) ، وإزالة غطاء زجاجي ، والسماح للسادة في الهواء الجاف تماما (عدة ساعات ليلة وضحاها).
   5. تخزين منصات في غطاء صندوق زجاجي في درجة حرارة الغرفة.
      
      
3. جعل إبرة لوادر حل الحمض النووي :
   
   يتم إنشاؤها لوادر إبرة من الأنابيب الشعرية 100 ميكرولتر التي يتم تسخينها في وسط أكثر من اللهب المكشوف وانسحبت بسرعة لمدة ما يقرب من مرتين. وقطعت شطري عدا مرة واحدة في الأنابيب الشعرية يبرد. مخزون وادر إبرة للحقن 10-20. مخزن تستقيم في microcentrifuge الرف الأنبوب. توخي الحذر حتى لا أسعد نفسه على نقطة.
   
   
4. جعل الإبر microinjection :
   
   يرصد الإبرة من أنبوب الشعرية الخاصة التي تحتوي على خيوط الزجاج الداخلية ، وهذه الخيوط هي بمثابة الفتيل من أجل حل الحمض النووي. يتم سحب هذه على جهاز إبرة مجتذب. نستخدم PP - 830 Narishige مجتذب مع إعداد الحرارة 24.8. يتم سحب الإبر عدة في وقت واحد ويتم تخزينها في مربع صغير من البلاستيك. ويمكن بسهولة متعددة الإبر "منصة" على شريط من الطين النمذجة للتخزين الطويل الأجل.
   
   
5. إبرة غيض "الخارجين" :
   
   يتم سحبها رأس الإبرة microinjection الغرامة بحيث يتم مغلقة فعليا عند نهاية وأنه ينبغي كسر المفتوحة باستخدام شظايا صغيرة من الزجاج غطاء. وتعد هذه الاشارات من 18 X 18 مم غطاء زجاجي في منشفة ورقية وتطبيق الضغط برفق حتى تقطع إلى عدة قطع. شظايا من حجم مفيدة ما يقرب من 3 × 4 مم.
   
   
6. تنمو البرية نوع (N2) الديدان إلى مرحلة الكبار في وقت مبكر عن طريق الحقن باستخدام الاجراءات القياسية ^6. تعد نحو 100 نظموا صحيح الديدان / بناء حقن.

إجراء

1. فتح صمام الرئيسي على دبابة الهيليوم التي متصلة microinjection ذراع وحامل إبرة. إغلاق صمام منظم للسماح للغاز للدخول على الخط ، ليصل الضغط إلى 35 رطل في البوصة المربعة. إشعار التي يمكن أن يتم الافراج عن الغاز باستخدام دواسة القدم.
   
   
2. اضافة الى وجود رافعة إبرة في الفم أنابيب pipetter القياسية (وجدت في حاوية من أنابيب الزجاج الشعرية) ووضع كمية صغيرة من الخليط البلازميد (~ 1 ميكرولتر).
   
   
3. وضعت بعناية لودر إبرة في نهاية الجزء الخلفي من إبرة الحقن ، وإدراج بلطف على طول الطريق من خلال طولويرى الإبرة حتى المقاومة. طرد حل الحمض النووي التي تهب بلطف ، ثم إزالة المحمل.
   
   
4. ادخال الإبرة في ذراعه microinjection ، والحرص على وضعه داخل طوقا المطاط الداخلية الصغيرة.
   
   
5. وضع كسرة إبرة كسر الزجاج غطاء على أحد حافة منصة آغار. تغطي قشرة ، وكذلك على سطح لوحة كاملة من آغار ، مع الهالوكربون النفط. مكان لوحة أغار على مرحلة مجهر مقلوب.
   
   
6. وضع الإبرة في وسط الميدان عرض باستخدام الهدف 4X وساطعة الإضاءة الميدان ، ولكن لا أقل إلا أنها في النفط. أيضا ، موقف الحافة الداخلية للقشرة من الزجاج تغطي في الوسط ، ثم التركيز على أنه (لا تزال تستخدم الهدف 4X). انخفاض الإبرة في النفط ، مما جعلها الطائرة التنسيق نفس كسرة من الزجاج غطاء. رفع التكبير عن طريق التحول إلى هدف 40X. إعادة التركيز على حافة قشرة وإعادة رأس الإبرة ، إذا لزم الأمر.
   
   
7. لفتح رأس الإبرة الحقن ، ودفع الإبرة برفق على حافة الغطاء كسرة الزجاج ، بينما في الوقت نفسه تطبيق نبضة قصيرة من الغاز عن طريق دواسة القدم. وسيتم الإبرة مكسورة بما فيه الكفاية عندما فتح قطرات صغيرة من السائل الهروب نهاية الإبرة. تدفق السوائل الزائدة بسبب فتح كبيرة جدا غير مرغوب فيه ، لأنها سوف تقتل الحيوانات.
   
   
8. إزالة لوحة آغار من مرحلة عن طريق رفع الإبرة ، ولكن لا تغير في موقف أو X - Y - المحور. الشريحة المرحلة من تحت الإبرة ، وإزالة لوحة آغار ووضعه على مجهر تشريح. نقل دودة كي تستقر على الوسادة ، تحت سطح الزيت. إذا التواءات دودة ، والسكتة الدماغية برفق حتى اتصالات لوحة آغار. وينبغي أن الدودة رطبة التمسك agarose الجافة.
   
   
9. حقن
   1. المكان بسرعة خلف منصة أغار على خشبة المسرح ، وتركزت الدودة في مجال الرؤية.
   2. انخفاض الإبرة في نفس الطائرة من التركيز على الدودة.
   3. تبديل المرشحات لالإضاءة هوفمان (نوع من تصفية التباين). وهذا يسمح بالتفصيل المورفولوجية من الدودة لتصبح مرئية. إذا Nomarski / مدينة دبي للإنترنت بصريات متاحة على نطاق مقلوب التي ستعمل كذلك. الهدف باستخدام 40X ، والتركيز على مركز "محببة" المخلوي في الغدد التناسلية دودة ، تحت نمط "العسل" من نوى الجرثومية (اختر أيهما التناسلية يتوضع على الجانب من الدودة التي تواجه الإبرة).
   4. صقل موقف الإبرة حتى التلميح أيضا في التركيز (الطائرة ذاتها في "التحبب" الغدد التناسلية).
   5. إدراج بلطف الإبرة في وسط الغدد التناسلية وتطبيق نبضة قصيرة من ضغط الغاز لطرد قطرة أو اثنتين من الحمض النووي في الذراع الغدد التناسلية. يجب أن نلاحظ انتشار موجة من السائل عبر الغدد التناسلية القاصي. لا تتحمل المزيد من السائل هو أفضل ، لأن الكثير من السوائل يمكن أن تتدفق إلى ثني ذراع القريبة من الغدد التناسلية ، والتي يمكن إيقاف إنتاج البويضة. إذا كان ذلك ممكنا ، تبعا للموقف من الدودة ، وضخ الذراع التناسلية الأخرى بنفس الطريقة.
   6. من المهم العمل بسرعة في حين حقن الدودة ، لأنها يمكن أن يجفف بسهولة. قرار لحقن ذراع التناسلية الثاني يعتمد على مدى السرعة التي يمكن إعادة وضع الإبرة ودودة. ينبغي أن تأخذ العملية برمتها بشكل مثالي أقل من 1-2 دقائق.
      
      
10. إزالة الزجاج غطاء من مرحلة وضعها على نطاق تشريح. تطبيق 1μl العازلة من M9 (22mm و KH ₂ PO ₄ ، 42mM نا ₂ هبو ₄ ، 85mm و كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO ₄₎ مباشرة على دودة حقن (وهذا قد يستتبع غمر غيض ماصة تحت السطح من النفط الهالوكربون). يجب ترطيب المنطقة العازلة الدودة ، وسوف تطفو على السطح ثم قبالة منصة agarose. نقل الدودة إلى لوحة العادية باستخدام التقاط الدودة. ويمكن إعادة استخدام لوحة agarose عدة مرات أكثر حتى أنها أصبحت مشبعة جدا مع عازلة والديدان لم تعد تلتزم.

اختيار المعدلة وراثيا

1. يتم نقل حقن الديدان ، _و0 ف جيل ، لوحات فردية ، طازجة المصنف البكتريا (60 ملم) والسماح لها بالتكاثر. عادة ، يتم حقن الحيوانات المحتضنة في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية.
   
   
2. ويلاحظ أن F ₁ ذرية للحصول على أدلة من علامة المعدلة وراثيا (مثل مضان) باستخدام stereomicroscope الفلورسنت. كل الفلورسنت ، الناقل F _{1 ،} يتم استنساخ الحيوانات بشكل منفصل على لوحة جديدة (منذ تعتبر النسل من كل F ₁ خطا متميزا). يسمح للF ₁ المخنثين على الإنجاب. مرة أخرى ، وعادة ما يتم تنفيذ ذلك في عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية.
   
   
3. ويلاحظ في ₂ F توليد للحيوانات معدلة وراثيا كذلك. تعتبر F ₂ الحيوانات التي ورثت وأعرب عن مجموعة معدلة وراثيا "مستقرة" الخط.
   
   ملاحظة : في الحادي _و1 واوالعمر قد يكون هناك العديد من الحيوانات المحورة وراثيا ، لكنها ليست مستقرة. فإن الغالبية العظمى من الحيوانات المعدلة وراثيا F ₁ لا يمكن نشرها في F ₂ خطوط مستقرة.
   
   ملاحظة : للسيطرة على التغير في الجين في عدد النسخ ، وتوليد ما لا يقل عن ثلاثة خطوط مستقرة ومستقلة في بناء حقن.
   
   
4. ينبغي الحفاظ على كل سطر مستقل ومستقر كخط منفصلة من الديدان. ويمكن نشر كل سطر من خلال نقل الحيوانات المعدلة وراثيا عدة لوحة جديدة في كل جيل ، ويجب أن يتم تنفيذ هذا باستخدام stereomicroscope الفلورسنت إذا هو علامة اختيار الفلورسنت.

Discussion

عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من المهم أن نتذكر أن :
-- حقن مباشرة في مركز الغدد التناسلية
-- لا حقن السائل الكثير
-- العمل بسرعة لمنع أصاب.

إذا واجهت مشاكل مع الإبرة ، مثل كسره كبيرة جدا ، فمن الأفضل لإعادة إبرة جديدة ، بدلا من محاولة لحقن مع أقل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645