بدعم من قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) وناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq). ونحن ممتنون للحكام الذين المجهول التعليقات ساعدتنا تحسين كل من مخطوطة والفيديو.

وكانت جميع المواد الكيميائية المخزنة المخفف في شكل صلب ، مثل OHDA - 6 و آبومورفين ، في الماء وتصفيته حقن معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي ، لتجنب التلوث. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخزين المواد سامة للأعصاب وneuroactive ، أعدت ومعالجتها والتخلص منها وفق الضوابط التي تحددها المبادئ التوجيهية الدولية (6) واللجنة المحلية للسلامة الأحيائية. 1 -- التخدير والجراحة وpremedicated الكبار الفئران السويسرية الذكور (25 30G) مع الأتروبين (0.2 ملغ / كلغ ، SC) للحد من لهجة المبهمي وتخدير ثم مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (90-120 ملغ / كلغ) ، وزيلازين (10 ملغ / كلغ) . يتم وضع الحيوان على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها الكترونيا (إنسايت) لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، وتحريض التخدير يأخذ بعض دقائق. يتم فحص مستوى التخدير في جميع أنحاء الداخلي عن طريق اختبار غياب المنعكس الانسحاب. وينبغي أن جرعة مخدر ajusted لكل سلالة / مستعمرة. اعتمادا على الحيوان ومدة العملية الجراحية ، قد جرعات إضافية من الكيتامين يكون ضروريا. بعد ذلك ، يتم تطبيق ملحي (كلوريد الصوديوم 0،9 ٪) في كلتا العينين لحماية القرنيات من الجفاف واختبار غياب المنعكس طرفة في هذا اللحظة الأولى. غير حليق والفراء على رأسه بأكمله مع الانتهازي لضمان الحد الأدنى من الاتصال مع المناطق غير معقمة. يتم تطبيق مخدر موضعي (Xylocaine) إلى أشرطة الأذن لمنع عدم الراحة. مرة واحدة فقط الانسحاب وميض منعكس قد تلاشت ، مما يدل على مستوى التخدير عميقة بما فيه الكفاية لعملية جراحية (المرحلة 3) ، ويتم وضع الحيوان على الإطار التجسيمي باستخدام قطعة الفم والأذن القضبان مصممة خصيصا لهذه الأنواع (إنسايت). يتم تطبيق positionated مرة واحدة ، مرهم العيون (ماركا) لحماية العينين الحيوان في جميع الجراحة. إلا بعد أن تتأكد من أن محمية بشكل صحيح العينين ، وإجراء متابعة تطهير الجلد في المنطقة من خلال تكرار العمليات الجراحية ثلاثة طلبات من اليود البوفيدون تليها الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام القطن مسحات معقمة وبعد والتنسيب المناسب من أشرطة الأذن هي كفل من خلال اختبار للحركات جانبية للرأس (يجب أن لا يتحرك الرأس لضمان أن يتم إصلاح آمن القضبان). وسيتم التحقق من الميل ظهري بطني السليم للرئيس في وقت لاحق عندما يتم الكشف عن معالم الجمجمة. يتم إجراء شق السهمي (1.5 سم) مع مشرط معقم (شفرة # 15). يتم كشط بلطف السمحاق فوق منطقة ذات الاهتمام بعيدا مع شفرة جديدة ، ومحو نظيفة العظام مع النظرة العقيمة ومسحات القطن ، للكشف عن معالم الجمجمة : يعرف bregma كنقطة تقاطع الخيوط السهمي والاكليلية ، في حين امدا هي نقطة تقاطع الدرز السهمي وأفضل خط يمر عبر احتواء الأجزاء الأيسر والأيمن من الدرز اللامي. وركزت أولا غيض من إبرة المرجعية محاذاة عموديا في bregma ، قيد البحث والدراسة من خلال الميكروسكوب الجراحي ، وانتقلت بعد ذلك إلى تلمس نقطة لامدا. إذا تم وضع الرأس بشكل صحيح ، يجب أن يكون لامدا على المستوى ظهراني بطني نفس bregma ، وكلاهما من معالم ينبغي أن تكون بعيدة بمقدار 4.2 ملم على طول محور rostro - الذيلية. إذا لم يكن كذلك ، ينبغي أن الآذان والحانات الأنفية يمكن تخفيف وإمالة الرأس بدقة حول محور interaural ، من أجل تحقيق الموضع المطلوب ، والذي يحدد &quot;مسطح الجمجمة&quot; مرجعية للتدابير stereotaxical. ثم يتم وضع طرف الإبرة المرجعية في الإحداثيات المطلوب : الأمامي الخلفي (ا ف ب +0.5 ملم) والأفقي (L -2.0 ملم ، واليسار). ويتميز الموقع على الجمجمة وفتح الصغيرة (1.2 مم) مع فتحة مثقاب معقمة ، وذلك باستخدام العمل المتقطع لمنع الحرارة في المنطقة. تتم إزالة شظايا العظم بعناية مع مكشطة الأسنان وغسلها مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ الدافئة المعقمة. غير محملة الحل 6 OHDA (أو مركبة للحيوانات السيطرة) ومحاذاة عموديا في الجهاز التجسيمي ؛ ال 5 ميكرولتر تعقيم المحاقن هاميلتون (0.47 مم الخارجي 26s مقياس). ثم يتم إدخال رأس الإبرة (النوع 2 أو 12 درجة شطبة) في الحفرة المفتوحة ، حتى تلمس سطح حنوني ، والحاسم على نقطة مرجعية للتنسيق ظهراني البطني. الحاسم مرة واحدة هذا التنسيق ، يتم تخفيض ببطء الإبرة للوصول إلى إحداثيات المخطط (ا ف ب : +0.5 ؛ L : -2.0 وDV : -3.0 مم ، تحت سطح حنوني 7). ثم يتم حقن محلول 6 OHDA (10 ميكروغرام في 6 OHDA كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ مع حمض الاسكوربيك 0.02 ٪) ، الذي تم إعداده وتصفيتها داخل غطاء تدفق الصفحي ، ويجب أن تكون محمية من الضوء من رقائق الألومنيوم في جميع أنحاء الداخلي ، في معدل تدفق 0.1μL/min. للحيوانات السيطرة ، يتم حقن حجم مساو من السيارة (0.02 ٪ حمض الأسكوربيك بنسبة 0.9 ٪ وكلوريد الصوديوم في الماء المعقم). بمجرد حقن ميكرولتر 2.0 بأكمله ، يتم الاحتفاظ بها في مكان الحقنة لمدة 5 دقائق قبل ان يتراجع ببطء جدا من الدماغ ، في ما لا يقل عن 5 في دقائق. يتم تنظيف الجمجمة ويتم إغلاق الجرح باستخدام خياطة # 6-0 النايلون (Shalon). لاتخاذ اضافيةالرعاية ضد العدوى ، قد يكون تطبيق مرهم مضاد حيوي المحلية ، مثل النيوميسين ، لخياطة الجلد. تتم إزالة الحيوانات من الإطار ، ونظرا 0.5 مل من المياه المالحة (sc.) لمنع الجفاف ، وأبقى الدافئة وتحت مراقبة وثيقة حتى الشفاء التام. ثم انهم يسكنون مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. يضاف مسكن للشرب زجاجة مياه لاول يومين بعد الجراحة (نظرا بمتوسط ​​استهلاك المياه يوميا من 5.5 لتر ، والجرعة الموصى بها من ايبوبروفين 0.03 ملغ / غرام من وزن الجسم / يوم ، ويضاف 0،82 مليلتر من 20 ملغ / مل ايبوبروفين - ابوت التعليق الى 100 مل مياه الشرب). الفئران وعادة ما يشفى بسرعة من هذا الإجراء ، والوصول للتجول كريات الغذاء والماء بسهولة. في أي حالة من الانزعاج واضح ، أو أي علامة على الإصابة ، يجب أن يتم التخلص الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية. 2 -- اختبار السلوكية ويمكن ملاحظة على الرغم من الإعاقات الحركية بعد أسبوع ، ما سمح لفترة ما بعد الآفة من قبل شهر واحد تقدير موثوق بها مع اختبار التناوب. الحيوان يتلقى الحقن تحت الجلد من آبومورفين ناهض DA (0.5 ملغ / كلغ) ، ويتم وضعها في اسطوانة مبهمة بقطر 30 سم ، 45 سم وضعها تحت كاميرا التسجيل. ومن المهم لإزالة أي رواسب والروائح من الحيوانات المختبرة سابقا قبل كل اختبار. بعد فترة التعود 5 دقائق ، يتم تسجيل الحركات على مدى زمني 5 دقائق. وتقاس كلا مضاد والمماثل لكامل الجسم والتناوب مقارنة مع مجموعة التحكم (حقن السيارة). إذا أجريت بشكل صحيح الداخلي ، وسوف الحيوانات السيطرة لا يحمل أي التناوب ، في حين أن 6 OHDA الحيوانات lesioned ستبدأ تحول إلى الجانب المقابل ، ومنذ ناهض ينشط بالدرجة الاولى المخطط مفرط الحساسية مزالة العصب على الجانب lesioned. وتعتبر الحيوانات يحرز أكثر من 7 في الدقيقة (عرض لا يقل عن 7 لكامل الجسم المقابل تناوب في الدقيقة) كما lesioned بنجاح. ويمكن للحيوان وعاد بسلام إلى 30 دقيقة من السكن بعد الاختبار ، والتي يمكن ان تتكرر أسبوعيا. في أيدينا ، وعرضها أقل من 5 ٪ من الفئران lesioned معدلات الدوران دون المستوى الأمثل.

<ol>
	<li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-hydroxy-dopamine+induced+degeneration+of+central+monoamine+neurons.">6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.</a> Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).</li><li>Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+through+delivery+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+by+neural+stem+cells+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).</li><li>Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+NF-kappaB+activation+prevents+dopaminergic+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).</li><li>Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., H&#246;glinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+striatal+6-OHDA+model+of+Parkinson's+disease+in+wild+type+and+a-synuclein-deleted+mice.">Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice.</a> Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).</li><li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-Hydroxydopamine-induced+degeneration+of+the+nigrostriatal+dopamine+pathway:+The+turning+syndrome.">6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome.</a> Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , 209 (2003).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Hudson, J. L., Horne, C. G. v. a. n., Str&#246;mberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+apomorphine-+and+amphetamine-induced+turning+with+nigrostriatal+dopamine+content+in+unilateral+6-hydroxydopamine+lesioned+rats.+Brain+Res.">Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res.</a> , 626-6167 (1993).</li><li>Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+preclinical+model+of+Parkinson's+disease:+A+study+of+behaviour+in+rats+with+graded+6-OHDA+lesions.">Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions.</a> Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).</li><li>Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ole+Isacson:+Development+of+New+Therapies+for+Parkinson's+Disease.">Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease.</a> JoVE. 3, (2007).</li></ol>

وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لرعاية واستخدام الثدييات في علم الأعصاب والسلوك بحوث<sup&gt; 6</sup&gt; ، بعد موافقة لرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (Comissão دي دي الالتزام بتعميم الخدمات دي Avaliação Animais Pesquisa م : UFRJ / CAUAP بروتوكول DAHEICB # 027). وقد اتخذت تدابير كافية للحد من الألم والانزعاج من حيوانات التجارب.

لا يمكن أن يتحقق من جانب واحد آفة واسعة من المسار nigro - مخططي موثوق في الفئران عن طريق الحقن واحد من التجسيمي OHDA - 6 في المخطط. يمكن التحقق من مدى الآفة بعد الوفاة من قبل المناعية للهيدروكسيلاز التيروزين (الذي يحفز معدل الحد من مرحلة تجميع DA ، أي تحويل التيروسين - L لdihydroxyph...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>90-120 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylazine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Atropine Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
</tr>
<tr>
<td>6 &#x2013; Hydroxydopamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;g/&mu;L</td>
</tr>
<tr>
<td>L - Ascorbic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.2%</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ASTRA Chemistry</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5% 50 mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Altana Pharma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 mg/g + 250 Ul/g</td>
</tr>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NOVARTIS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> 0.33%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ibuprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 mg/ 100 ml drinking water</td>
</tr>
<tr>
<td>Povidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JohnsonDiversey</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model for parkinson's disease: from 6-oh dopamine lesion to behavioral test

مرض باركنسون (PD) يؤثر على ما لا يقل عن 6.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، بغض النظر عن الجنس ، والحدود الاجتماعية والعرقية والاقتصادية ، أو جغرافية. الأعراض الرئيسية ، مثل الصلابة ، ورعاش وbradikinesia ، تتطور عندما يتم فقدان حوالي 3 / 4 من خلايا الدوبامين في المادة السوداء ، وتفشل في توفير التنظيم والتنسيق السلس للدوائر مخططي السيارات. الاكتئاب والهلوسة شائعة ، والخرف في نهاية المطاف يحدث في 20 ٪ من المرضى. في هذا الوقت ، لا يوجد علاج لتأخير أو وقف تطور PD. بل إن الهدف الأدوية المتوفرة حاليا أكثر من أجل التخفيف من هذه الأعراض. قد استراتيجيات جراحية جديدة التبديل عكسية على الدوائر العصبية المتضررة وظيفيا من خلال التحفيز الكهربائي للهياكل العميق للمخ ، ولكن على الرغم من أن للمخ يمثل تقدما كبيرا ، فإنه ليست مناسبة لجميع المرضى. ولذلك يبقى من الضروري اختبار نهج جديدة في علاج الخلايا نماذج قبل سريرية. يمكن استنساخها اضطراب أعصاب الانتقائي للمسارات الدوبامين عن طريق الحقن من hydroxydopamine - 6 (6 - OHDA) أو MPTP (1 ميثيل فينيل - 4 - 1 - ،2،3،6 tertahydropyridine) في حين أوزون المخدرات والمواد الكيميائية المؤكسدة الضارة قد تتكاثر أيضا ميزات محددة من المشتريات في القوارض. خلافا MPTP ، 6 - OHDA الآفات العصبية تسبب في خسارة عدد هائل لا رجعة فيه ، ويمكن أحادي أو ثنائي. نموذج الآفة 6 OHDA غير موثوق بها ، ويؤدي إلى عجز المحرك القوي ، وهو الأكثر استخداما على نطاق واسع بعد 40 عاما من البحث في rats1. كما يمكن الآن التفاعلات بين الخلايا المطعمة والمضيف أن تدرس بدقة أكثر في الفئران وليس في الفئران ، فقد تم نقلها إلى نموذج 2،3 الفئران ، حيث تم مؤخرا أنها تتميز 4. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية آفة اليسار nigro - مخططي مسار تخدير الفئران عن طريق تقديم ببطء 2.0 ميكرولتر من OHDA - 6 من خلال إبرة حقنة صغيرة إدراج stereotaxically. فقدان الإدخال الدوبامين يحدث في غضون أيام ، ويمكن رصد أكثر من اعاقات وظيفية بعد الجراحة الأسابيع والأشهر التي تناوب تصنيف الحيوانات التي تحدثها عوامل الدوبامين 5. هنا ، ونعرض كامل الجسم تناوب المقابل تحدث بعد 10 دقائق من ادارة واحدة تحت الجلد من آبومورفين ، وتقاس بعد شهر واحد الآفة. وتناقش النتائج والسلبيات أدناه.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test at JoVE.com

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

ويتسبب مرض باركنسون بفقدان تعصيب الدوبامين في المخطط ، والذي يمكن أن يتسبب تجريبيا بواسطة 6 - OH الدوبامين. نحن تصف كيفية تنفيذ الآفة التجسيمي ورصد آبومورفين بفعل السلوك التناوب في الفئران. هذا النموذج هو مفيدة وموثوقة لاختبار علاجات جديدة لمرض باركنسون.

فأري النموذجي لمرض باركنسون : من آفة الدوبامين 6 - OH إلى اختبار السلوكية

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

murine-model-for-parkinson-s-disease-from-6-oh-dopamine-lesion-to

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

31.4K Views.  Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. ويتسبب مرض باركنسون بفقدان تعصيب الدوبامين في المخطط ، والذي يمكن أن يتسبب تجريبيا بواسطة 6 - OH الدوبامين. نحن تصف كيفية تنفيذ الآفة التجسيمي ورصد آبومورفين بفعل السلوك التناوب في الفئران. هذا النموذج هو مفيدة وموثوقة لاختبار علاجات جديدة لمرض باركنسون.

Video: Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson&#039;s Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Isacson أوله : تطوير علاجات جديدة لمرض باركنسون

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). The most common pattern observed in the clinic is the peak-dose dyskinesia which consists of clinical manifestations of choreiform, dystonic, and ballistic movements. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of PD mimics several characteristics of LIDs. After repeated L-DOPA administration, 6-OHDA-lesioned rats exhibit dyskinetic-like movements (e.g., abnormal involuntary movements, AIMs). This protocol demonstrates how to induce and analyze AIMs in 6-OHDA-lesioned rats with 90%-95% dopaminergic depletion in the nigrostriatal pathway. Repeated administration (3 weeks) of L-DOPA (5 mg/kg, combined with 12.5 mg/kg of benserazide) can induce the development of AIMs. The time course analysis reveals a significant increase in AIMs at 30-90 min (peak-dose dyskinesia). Rodent models of LIDs are an important preclinical tool to identify effective antidyskinetic interventions.

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson&#039;s Disease

Rodent models of L-DOPA-induced dyskinesias are invaluable tools to identify therapeutic interventions to attenuate the development or alleviate the manifestations that emerge due to the repeated administration of L-DOPA. This protocol demonstrates how to induce and analyze dyskinetic-like movements in the unilaterally 6-OHDA-lesioned rat model of Parkinson's disease.

تصنيف خلل الحركة الناجم عن L-DOPA في نموذج الفئران المصاب من جانب واحد 6-OHDA لمرض باركنسون

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

3D ثقافة المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية والخلايا الجذعية واحدة

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

تسليط الضوء على المؤلف: زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...