تم عمل وانغ يانغ Z Y بفضل منحة من AR051181 K02 NIAMS / المعاهد الوطنية للصحة ، والمنح من رابطة الضمور العضلي ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية لانغ واي. ويدعم عمل تسنغ سؤال وشو X من قبل برنامج المنح التي منحت للمختبر التصوير الضوئي من بريغهام ومستشفى النساء. فإن الكتاب أود أن أشكر ليو ون من قسم التخدير ، BWH ، للمساعدة التقنية في أعمال الخلية.

إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القمر الصناعي زنزانة انفرادية <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت تأثير مخدر ، تتم إزالة عضلات الاطراف من الفئران المعدلة وراثيا GFP (C57BL / كا βactin - EGFP). بعد قطع الى قطع صغيرة ، والخلايا الأقمار الصناعية هي التي تفرخ إنزيمي فصل الأنسجة المفروم مع 2 ٪ dispase حل كولاجيناز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد انزيم الهضم مع وسائل الإعلام التي تحتوي على نمو هام من طراز F - 10 و FBS 20 ٪ ، وتنأى في العضلات التي تتكرر مع الطحن ماصة باستور. يتم تصفية هذه الخلايا من خلال مصفاة الخلية (ø70 - 100μm) ومطلي ثم على طبق غير المغلفة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف وطاف بها على لوحة طبق الكولاجين المغلفة. كرر هذه الخطوة في وقت لاحق 1 ساعة لتنقية myoblasts. (قبل لوحة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام ولوحة الخلايا في الوقت المناسب. يتم تربيتها في myoblasts النهائي المنقى في المتوسط ​​تحتوي على لحم الخنزير F - 10 ، و 20 ٪ FBS ، 100 البنسلين يو / لتر ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (متوسطة النمو) عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO2 ، والهواء 95 ٪. </li></ol> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة وتوسيع myoblasts الابتدائية في وسط النمو مع اضافة جمعية جيل المستقبل الأساسية من 10 نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للجميع في التجارب المجراة ، ونحن ضخ 5x10 5 خلايا العضلات في TA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما حصاد myoblasts ، ونحن في فصل الخلايا باستخدام 0.25 ٪ التربسين / EDTA وغسلها مع برنامج تلفزيوني مرتين. يتم حساب الأرقام الخلية مع عدادة الكريات ومعلق الخلايا في HBSS في تركيز خلايا 5x10 4 / ميكرولتر. وتوضع الخلايا تتركز في HBSS على الجليد وحقنه في حدود 1 ساعة بعد جمعها. </li></ol> التصوير في فيفو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شراؤها من الذكور الفئران MDX في سن 4-6 أسابيع من مختبر جاكسون والحفاظ على حيوان مرفق الإسكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حوالي أسبوع واحد من خيارات السكن والبيئة ، والفئران جاهزة للزرع مع الخلايا المستزرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل زرع الخلايا ، والفأر هو تخدير عن طريق حقن (IP) داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). ثم تتم إزالة الشعر في جميع أنحاء المنطقة من خلال تطبيق العضلات TA ناير في ساقه والانتظار لمدة 30 ثانية للقضاء عليه نظيفا بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الماوس لا يزال تحت التخدير ، ويتم حقن الخلايا ببطء 5x10 5 في HBSS 10μl في كل عضلة في TA 3 نقاط باستخدام إبرة قياس 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة 4 ، ويمكن تصوير الماوس بشكل منتظم من قبل في مجال التصوير مضان الجسم الحي. يستخدم التصوير مضان محطة NightOwl LB981 (برتولد تكنولوجيز ، وشركة) ، ومجهزة بكاميرا المسؤول عن حساسية عالية بالإضافة إلى الحصول على الصور من الساقين تعيق من الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم التصوير في الجسم الحي ، ونحن أولا التحقق من إعادة نمو الشعر على العضلات TA. إذا لزم الأمر ، ونحن إعادة تطبيق ناير لإزالة الشعر على النحو الموصوف أعلاه ، وبعد التخدير والفأر مع مزيج من الكيتامين وزيلازين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الفأر هو تحت التخدير ، ونضع الماوس في وضعية الرقود على قطعة من الورق غير الفلورسنت السوداء (أسود Artagain الورق من ستراثمور). لفضح تماما العضلات TA لأفضل تصوير ، ونحن الشريط الكفوف الخلفيتين للصحيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع الماوس في غرفة التصوير ووضع الساق الخلفية ليمكن تصوير في مركز مجال الرؤية للكاميرا. نحن أول من تبديل فلتر الانبعاثات لاتخاذ الرمادية التقليدية على نطاق الصورة الفوتوغرافية من الساق مع وقت تعرض 5 ثوان. تعدل الموقف من الفأرة وتركيز الكاميرا إذا لزم الأمر. يتم الاحتفاظ معلمات التصوير بما في ذلك وقت التعرض (1250 مللي ثانية) ، وارتفاع العينة (0.9 سم) الخ المستمر في عملية تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن ثم التبديل في تصفية الانبعاثات المناسبة لطول الموجة بروتين الفلورية الخضراء. نحن نأخذ صورة مضان مع وقت التعرض لل1250 مللي ثانية وعدد binning 1. بعد التصوير ، ويتم إزالة الماوس من غرفة التصوير لقفص الانتظار الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحليل ، ونحن نرسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عبر إشارات لقياس كثافة الفلورية من حيث الفوتونات في الثانية الواحدة. ونحن أيضا قياس حجم العائد على الاستثمار من حيث عدد بكسل كما الكمي قيمة أخرى. ويمكن تكرار التجارب التصوير كل أسبوع أو أكثر بشكل متكرر على مدى بضعة أشهر ، إذا لزم الأمر ، للحصول على البيانات الطولية. </li></ol> في نهاية التجارب ، والموت الرحيم الماوس ويتم حصادها في عضلة TA لتحليل الأنسجة.

<ol>
	<li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo.">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li><li>Green, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography.">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li><li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models.">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li><li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography.">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li><li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers.">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 .</li><li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths.">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li><li>Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+of+muscle+regeneration+by+transplanted+eGFP-labeled+myoblasts.">In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts.</a> , (1985).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins.">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li><li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy:+I.+A+histological,+morphometric+and+biochemical+investigation.">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells.">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li><li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne's+muscular+dystrophy.">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li><li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+current+approaches+and+future+directions.">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li><li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts.">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li><li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells,+bone+marrow+cells,+and+hematopoietic+stem+cells.">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li><li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li></ol>

أنشأنا منصة التصوير موثوقة ومستقرة لتتبع الخلايا التي تم زرعها مضان المسمى في عضلات الهيكل العظمي المضيف في هذه الدراسة. GFP المسمى myoblasts من GFP الماوس المعدلة وراثيا لتقف على نوع من الخلايا الجذعية البالغة التي من شأنها أن تكون مرشحة لعلاج الخلايا في المستقبل. التلاعب المستمر بما في ذلك عدد الخلايا ، وحقن الخلايا ، والخلفية واضحة وموقف المعلمة آلة التصوير ومهم من أجل الحصول على صورة ذات جودة عالية وخاصة بالنسبة للتحليل الكمي. مضان التصوير والعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية كما هو غير الغازية ، وسهلة الاستخدام ، ويحتوي على إنتاجية عالية. بالإضافة التصوير مضان يمكن أن يوفر القياس الكمي على أساس تهم الفوتون ، وإن كان يرجع ذلك إلى توهين ، وتشتت والاستيعاب ، ويمكن أن لا تتمكن من اختراق الضوء على مسافة كبيرة في الأنسجة ، والذي هو أحد أوجه القصور في الأسلوب. وقد بذلت جهود جارية لاستخدام مراسل حمراء أو تحت الحمراء القريبة لزيادة عمق الاختراق من الضوء. ميزة أخرى من التصوير مضان هو أنه للترجمة إلى العيادات في حال الموافقة على مراسل الفلورسنت محددة للاستخدام البشري. بالمقارنة مع MRI ، CT ، والدائرة ، ومضان التصوير ومرونة عالية لأنها لا تتطلب أجهزة مكلفة وكلاء التصوير. مثال واحد هو مضان المستندة المنظار المنظار ومتناهية الصغر ، التي تم استخدامها في العيادات. من خلال الجمع بين التصوير مضان مع طرائق أخرى ، ونحن نتوقع تحقيق القدرة على اكتساب المعلومات على حد سواء التشريحية والوظيفية عن عمليات بيولوجية كامنة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NightOwl LB981</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Berthold Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tracking dynamics of muscle engraftment in small animals by in vivo fluorescent imaging

ضمور العضلات عبارة عن مجموعة من الأمراض التنكسية العضلات تتميز الفقدان التدريجي للخلايا العضلات مقلص. حاليا ، لا يوجد علاج العلاجية المتاحة. لقد ولدت التطورات الأخيرة في بيولوجيا الخلايا الجذعية آمالا جديدة لتطوير علاجات فعالة تستند الخلية لعلاج هذه الأمراض. وقد استخدم زرع أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية المسمى مع البروتينات الفلورية في عضلات النماذج الحيوانية التصنع على نطاق واسع في هذا المجال. وهناك تقنية غير الغازية لديها القدرة على تتبع مصير الخلايا المزروعة يمكن طوليا كذلك قدرتنا على تقييم من قبل خلايا العضلات engraftment زرع أكثر دقة وكفاءة. في هذه الدراسة ، ونحن تثبت أن في الجسم الحي مضان التصوير هو طريقة حساسة وموثوق بها لتتبع GFP المزروع (البروتين الفلوري الأخضر) المسمى الخلايا في عضلات الهيكل العظمي الماوس. على الرغم من القلق إزاء الخلفية نظرا لاستخدام الضوء الخارجي اللازمة لاستثارة للبروتين فلوري ، وجدنا أنه من خلال استخدام الفأرة إما عارية أو القضاء على الشعر مع الكواشف إزالة الشعر هو القضاء على جزء كبير من هذه المشكلة. باستخدام كاميرا CCD ، ويمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت في العضلة الظنبوبية (TA) الأمامي بعد حقن الخلايا 5 × 5 10 إما من الفئران المعدلة وراثيا أو GFP eGFP transduced myoblast الثقافة. للعضلات أكثر سطحية مثل إبهام اليد الباسطة لأصابع (EDL) ، وحقن الخلايا تنتج أقل من إشارة يمكن كشفها. ويمكن قياس شدة الإشارة وكميا في عدد الفوتونات المنبعثة في الثانية الواحدة في المنطقة ذات الاهتمام (ROI). منذ حصلت على الصور تظهر حدود واضحة ترسيم منطقة engrafted ، يمكن قياس حجم العائد على الاستثمار كذلك. إذا كان يتم وضع الساقين باستمرار في كل مرة ، والتغييرات في عدد من الفوتونات في الثانية الواحدة في العضلات وحجم العائد على الاستثمار يعكس التغييرات في عدد من الخلايا engrafted وحجم المنطقة engrafted. لذا فإن التغيرات في العضلات نفسها مع مرور الوقت وقابلة للقياس الكمي ، وفي الجسم الحي وقد استخدمت تقنية التصوير الفلورسنت أساسا لتعقب نمو الخلايا tumorogenic ، دراستنا تبين أنه أداة قوية تمكننا من تعقب مصير الخلايا الجذعية المزروعة.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging at JoVE.com

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

نحن تصف<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مضان التصوير بروتوكول لرصد تجديد العضلات التي GFP المسمى myoblasts بعد زرع في عضلات الهيكل العظمي من الفئران على حد سواء صحية والتصنع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة تجديد العضلات بزرع أنواع أخرى من الخلايا والعضلات في ظروف أخرى كذلك.

تتبع المسار Engraftment العضلات في الحيوانات الصغيرة من قبل في فيفو نيون التصوير

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

9.7K Views.  Brigham and Woman's Hospital. نحن تصف في الجسم الحي مضان التصوير بروتوكول لرصد تجديد العضلات التي GFP المسمى myoblasts بعد زرع في عضلات الهيكل العظمي من الفئران على حد سواء صحية والتصنع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة تجديد العضلات بزرع أنواع أخرى من الخلايا والعضلات في ظروف أخرى كذلك.

Video: Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...