وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الاميركية زمالة Predoctoral لمبادرة التعلم المشتركة والمعاهد الوطنية للمنح R01AR056624 هيث.

ألف مفردة بوليمر Electrospinning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد حل electrospinning ، وجعل 0.5 ٪ بالوزن حل photoinitiator ، Irgacure 2959 (I2959) ، في ماء منزوع الأيونات عن طريق إذابة عند 37 درجة مئوية لعدة أيام. هذه الخطوة غير ضرورية إذا لم يتم بوليمر photoreactive المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين حمض الهيالورونيك methacrylated (MeHA ، انظر Burdick وآخرون لتخليق) ، وبولي (أكسيد الاثيلين) (PEO ، و 900 كيلو دالتون) ، وI2959 في الماء منزوع الأيونات لإعداد الحل النهائي مع التركيز على 2 ٪ بالوزن MeHA ، 3 ٪ بالوزن PEO ، و 0.05 ٪ بالوزن I2959. استخدام مزيج من دوامة الحل حتى يتبين. يمكن تعديل نوع البوليمر والتركيز ، فضلا عن استخدام المذيبات في هذه الخطوة تبعا لخصائص سقالة المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل إلى حقنة وإرفاق قياس 18 ، 6 بوصة طويلة ، إبرة حادة نهاية إلى نهاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج ضخ حقنة لإخراج بمعدل 1.2 مل / ساعة. إدراج المحاقن والإبر في الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق يؤدي أساس مصدر الطاقة العالية الجهد لجهاز التحصيل. لجمع وزعت عشوائيا ألياف استخدام لوحة معدنية مسطحة ، أو استخدام مغزل بالتناوب في ~ 10 م / ث لجمع ألياف الانحياز. إرفاق يؤدي المشحونة إيجابيا على الإبرة. انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي لجهاز electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الجهاز إبرة أو جمع ، مثل وجود مسافة 15 سم بين الاثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تدفق على ضخ حقنة. عندما السائل هو تصور على رأس الإبرة ، بدوره على مصدر الطاقة وتعيين الجهد إلى 22 كيلو فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال جمع (من عدة دقائق للأفلام رقيقة ، لتصل إلى 24 ساعة لأكثر سمكا حصيرة) ، إزالة السقالة من جهاز جمع وتخزين تحت فراغ بين عشية وضحاها لضمان الإزالة الكاملة للمذيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور مورفولوجيا الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM) ، تظهر سقالة ممثل في الشكل رقم 1 لكلا هياكل الانحياز وعدم الانحياز. </li></ol> ملاحظة : معدل تدفق العينة ، والمسافة للوصول إلى جهاز جمع والجهد وتعتمد على الجمع بين البوليمر والمذيبات ويجب أن يكون الأمثل لكل نظام ، وعادة من خلال مراقبة التشكل سقالة مع SEM. وباء Photocrosslinking Photopatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 5mm 5mm X عينات من سقالة حصيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد لوضع كل يشابك بواسطة سقالة على شريحة زجاجية مغطاة احباط ، ووضع الضوئية الرئيسية مباشرة على منصة الاعدام ، وتغطي مع شريحة زجاجية نظيفة والقطع مع طرفي مقاطع الموثق. ملاحظة : يمكن القيام به أربع عينات في وقت واحد ، ويمكن استخدام الشفافية دون وجود نمط ليشابك إذا لم يتم المطلوب نمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين سقالة تطهير في برلمان النيتروجين. فمن المهم للحفاظ على بناء خالية من الأكسجين ، والتي يمكن أن تحول دون يشابك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان سقالة الإعداد في غرفة تحت النيتروجين ~ 10 ميغاواط / سم 2 365 نانومتر الخفيفة مع محول الموازاة لمدة 5 دقائق. انظر التخطيطي في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل سقالة والمكان في لوحة 12 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الماء منزوع الأيونات في كل بئر ، parafilm لوحة لمنع تبخر الماء والمكان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تغيير المياه ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور تشكيل المسام تحت المجهر الخفيفة (انظر المثال في الشكل 2). والسقالات الآن جاهز للاستخدام. </li></ol> ملاحظة : ليس من الضروري Photocrosslinking للعديد من أنواع البوليمرات ، ولكن يمكن فقط أن تستخدم photopatterning مع البوليمرات photoreactive. جيم مزدوجة بوليمر Electrospinning مع نيون التصور الالياف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ٪ بالوزن 5 حل PEO (200 كيلو دالتون) في الايثانول 90 ٪. ضجة عند 700 دورة في الدقيقة في 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى حل PEO حقنة وإضافة دابي لتركيز النهائي من التركيز ملغ / 10 مل في حل electrospinning. التفاف حقنة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نفس الحل خطوة وصفها في A2 ، باستثناء أيضا إضافة methacryloxyethyl thiocarbamoyl رودامين B (MeRho ، 683.24 جم / مول) لتركيز النهائي من 25 ميكرومتر في حل electrospinning. التفاف حقنة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشريط سكوتش بعناية لتأمين coverslips الزجاج methacrylated (انظر Khademhosseini وآخرون) إلى سطح مغزل. ملاحظة : سوف تصبح ألياف زجاجية مصطفة على coverslips methacrylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق قطعة واحدة من نهاية عملية طويلة من 5 ملم أنابيب السيليكون مع المرفقات قفل luer إلى واحد من المحاقن ونعلق على الطرف الآخر لإبرة. تضاف إلى ضخ حقنة حقنة ووضع الإبرة من خلال ثقب في fanner. كرر مع حقنة أخرى وfanner على موقع المعاكس للمغزل. وfanners ترجمة لوتستخدم ength من مغزل وضمان التوزيع المتساوي لكلا البوليمرات في سقالة الناتجة عن ذلك. انظر التخطيطي في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المعلمات وصفها في الفرع ألف وفقا للجدول رقم 1 بشكل مناسب. تأكد من أن تتركز النصائح إبرة على مغزل. الجدول 1. المزدوج بوليمر معلمات Electrospinning <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> محقنة </td><td> Fanner تلميح إلى الإبرة (سم) </td><td> تلميح إلى إبرة مغزل (سم) </td><td> معدل التدفق (مل / ساعة) </td><td> تطبيق الجهد الكهربائي (كيلو فولت) </td></tr><tr><td> MeHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> +22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> +15 </td></tr></tbody></table> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم محاذاة كل شيء بشكل صحيح ، إطفاء الأنوار وتشغيل مضخات مغزل والمحاقن. إزالة رقائق الألومنيوم من المحاقن. عندما السائل مرئيا على نصائح كل من الإبر ، وتتحول في وقت واحد على امدادات الطاقة والمكونات في fanners. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال جمع ، إيقاف إمدادات الطاقة ومغزل وافصل fanners. إزالة بعناية وcoverslips الشريط باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الألياف باستخدام المجهر الفلورسنت مجهزة بمرشحات لرودامين ودابي. انظر المثال في الشكل 3. ملاحظة : ألياف نيون هي الأكثر واضحة لعرضها عند electrospun لفترات قصيرة من الزمن (&lt;3 دقائق) ، ومع ذلك ، ويمكن تمديد هذه العملية للحصول على كمية غير محدودة من الزمن من اجل خلق بنيات أكثر سمكا ، ولا سيما من دون استخدام الزجاج coverslips . </li></ol> خلايا البذر دال على السقالات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل ساترة مع البوليمر electrospun تعلق في الفرد جيدا لوحة بئر بحجم مناسب. ملاحظة : التفاعلات الخلوية مع ألياف مرئية بسهولة على electrospinning coverslips methacrylated الزجاج. أيضا ، يمكن أن تستخدم مرة أخرى MeRho لرؤية الألياف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والسقالات في احتضان PBS بين عشية وضحاها لضمان الإزالة التامة للالمذيبات وأي المرتشحة ممكن من المنتجات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعقيم السقالات ، ووضعهم تحت مصباح مبيد للجراثيم في التدفق الصفحي غطاء لمدة 30 دقيقة. إذا كان يتم المصنف سقالة كاملة ، والوجه أكثر من السقالة ومكان تحت مصباح مبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قياسي خلية ثقافة ويعد تعليق خلية تتركز في كثافة الخلايا المطلوبة (على سبيل المثال ، 6000 الطول الخلايا -2). على سبيل المثال ، استخدم 100 مل من التعليق الخلية عن 22 مم X 22 مم ساترة. مكان في الحاضنة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف الكمية المناسبة من وسائل الإعلام إلى كل خلية ثقافة أيضا. وضع السقالات العودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على استخدام عدة خلايا متاحة تجاريا لايف / الميت. ملاحظة : يمكن تطبيق أنواع أخرى من تلطيخ الخلية ، مثل دابي (نواة الخلية) وphalloidin fluorescently المسمى (ألياف الأكتين الإجهاد) لتصور الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور خلايا وألياف باستخدام المجهر الفلورسنت مجهزة بمرشحات لTRITC وFITC. انظر المثال في الشكل 4. </li></ol> ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تخطيطي يوضح الإعداد لتشكيل جهاز سقالة عدم الانحياز (أعلى) ومحاذاة سقالة تشكيل (القاع). وترد سبيل المثال المجهر الإلكتروني الماسح الصور لكل نوع من السقالة. مقياس شريط = 5μm. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تخطيطي طريقة الزخرفة. تتشكل أنماط بوضع الضوئية الرئيسية بين مصدر الضوء وسقالة أثناء photocrosslinking ثم تجرف البوليمر غير المتفاعل. الضوئية الرئيسية وSEM صورة السقالات بعد تشكيل المسام وlyophilization. مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /> الشكل 3 تخطيطي لإعداد electrospinning متعددة البوليمر والمعلمات اللازمة لمعالجة البيانات ، وكذلك صورة ممثل الفلورسنت من خليط من السكان من الألياف اثنين (على سبيل المثال : MeHA الحمراء والزرقاء PEO). electrospun في نفس الوقت التي كانت لتشكل سقالة متعددة البوليمر . مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">انقر هنا</a> لرؤية أكبر versioن من الشكل 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تلطيخ صورة مثال لايف / الميت من خلايا الجذعية الوسيطة وتفاعلاتها مع الألياف electrospun. مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.

<ol>
	<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications.">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li><li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment.">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li><li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+on+the+Straight+and+Narrow:+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration.">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li><li>Sill, T. J., Von Recum, H. a. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , (2009).</li></ol>

كان يستخدم لإعداد Electrospinning السقالات ليفية من البوليمرات. Photocrosslinkable السقالات على أساس حمض الهيالورونيك استخدمت كمثال توضيحي ، حيث هناك حاجة إلى التعرض للضوء ليشابك. مع استخدام macromers رد الفعل ، مثل MeHA ، أدرجت القنوات التي أثبتت سابقا التوزيع المعززة الخلوية في السقالا...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DAPI</td>
<td> Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 200 kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>17503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 900 kDa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>189456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591-100</td>
<td>Prepare stock solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead Stain Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>Equipment</td>
<td>KD Scientific</td>
<td>KDS100</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Power Source</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gamma High Voltage</td>
<td>ES30P-5W</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Motor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triem Electric Motors, Inc</td>
<td>0132022-15</td>
<td>Must attach to a custom built mandrel</td>
</tr>
<tr>
<td>Tachometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Network Tool Warehouse</td>
<td>ESI-330</td>
<td>Use to monitor mandrel speed</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51135K151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Female Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K293</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Male Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-825-16H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Corning</td>
<td>2875-22</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture

باعتبار أن هذا المجال من تطور هندسة الأنسجة ، وهناك طلب هائل على انتاج مزيد من المواد المناسبة وتقنيات المعالجة من أجل تلبية الاحتياجات (على سبيل المثال ، الميكانيكا والأوعية الدموية) من أجهزة أكثر تعقيدا والأنسجة. Electrospinning هو الاسلوب الشعبي لإنشاء السقالات الليفية التي تحاكي العمارة ومقياس حجم المصفوفة خارج الخلية الأصلية. هذه السقالات ليفية مفيدة أيضا بمثابة ركائز الثقافة الخلية حيث يمكن استخدام ألياف لتوجيه السلوك الخلوية ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية (انظر نقدية مستفيضة Mauck<em&gt; وآخرون.</em&gt; وسيل<em&gt; وآخرون.</em&gt; لمزيد من المعلومات). في هذه المقالة ، نحن تصف عملية electrospinning العامة للبوليمرات وكمثال على ذلك ، وهو حمض الهيالورونيك electrospin التفاعل قادرة على يشابك مع التعرض للضوء (انظر Ifkovits<em&gt; وآخرون.</em&gt; لإعادة النظر في المواد photocrosslinkable). نقدم أيضا قدرات مزيد من المعالجة مثل photopatterning ومتعددة البوليمر تشكيل السقالة. يمكن استخدامها لإنشاء السقالات Photopatterning مع قنوات مسامية ومتعددة المستويات لزيادة عمليات التسلل الخلوية وتوزيع الأنسجة. متعددة البوليمر السقالات مفيدة لضبط أفضل الخصائص (الميكانيكا وتدهور) من سقالة ، بما في ذلك مسامية مصممة للتسلل الخلوية. وعلاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه التقنيات لتشمل مجموعة واسعة من البوليمرات وmacromers رد الفعل لإنشاء السقالات المعقدة التي توفر الاشارات اللازمة لتطوير بنيات الأنسجة نجاحا هندسيا.

Watch this Scientific Journal Video about Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture at JoVE.com

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

وتتناول عملية electrospinning البوليمرات للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة في هذه المقالة. على وجه التحديد ، هو وصفها electrospinning من macromers photoreactive مع قدرات معالجة إضافية من photopatterning وelectrospinning متعددة البوليمر.

Electrospinning السقالات بوليمر الليفية للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

electrospinning-fibrous-polymer-scaffolds-for-tissue-engineering-cell

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Views.  University of Pennsylvania. وتتناول عملية electrospinning البوليمرات للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة في هذه المقالة. على وجه التحديد ، هو وصفها electrospinning من macromers photoreactive مع قدرات معالجة إضافية من photopatterning وelectrospinning متعددة البوليمر.

Video: Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Experimental Approaches to Tissue Engineering

مقاربات تجريبية لهندسة الأنسجة

Micro-scale Engineering for Cell Biology

متناهي الصغر الهندسية لبيولوجيا الخلية

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

مقابلة : المفاعلات الحيوية والتعديل ، وظهرت السقالات 3D - لبحوث الخلايا الجذعية

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...