للبدء ، قم بزرع خلايا الساركوما العظمية البشرية 143B في صفيحة من ستة آبار. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 75٪ ، استبدل الوسط في كل بئر بالوسط الذي يحتوي على 10 مليمولار 13C4 من الأسبارتات ، واحتضانها لمدة ثماني ساعات لتحقيق حالة مستقرة لوضع العلامات على الخلايا. لعزل المستقلبات ، قم بتبريد المخزن المؤقت المحضر طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو ضعه على ثلج جاف.
في هذه الأثناء ، خذ صفيحة من الحاضنة واستنشق الوسط من كل بئر باستخدام ماصة. اغسله باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين ، ثم قم بإزالة PBS المتبقي قبل المضي قدما. الآن ضع اللوحة على الثلج الجاف وأضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر إلى كل بئر.
لتسهيل تحلل الخلايا ، احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد الحضانة ، اكشط كل بئر على الثلج الجاف باستخدام رافع خلوي ، وانقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 15 ملليلتر يوضع على الثلج الجاف. دوامة المحللة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية و 17،000 غرام لمدة 10 دقائق.
ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر وجففها في مكثف فراغ أربع درجات مئوية مع مصيدة باردة تحت فراغ عالي لمدة ست ساعات تقريبا. قم بتخزين حبيبات الأيض المجففة في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. لتحليل العينة باستخدام مطياف الكتلة اللوني السائل أو LCMS ، أضف 100 ميكرولتر من ماء درجة HPLC إلى الحبيبات المجففة والدوامة كما هو موضح.
أجهزة الطرد المركزي العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة. ثم انقل 25 ميكرولترا من المادة الطافية إلى قارورة LCMS ، وحقن ميكرولتر في نظام LCMS. لإجراء الكروماتوغرافيا السائلة ، استخدم معدل تدفق ثابت يبلغ 0.15 ملليلتر في الدقيقة ، تحت وضع التدرج للمرحلة المتنقلة B من 80 إلى 20٪ لمدة 20 دقيقة ، 20 إلى 80٪ لمدة 0.5 دقيقة ، مع الاستمرار عند 80٪ لمدة 7.5 دقيقة ضد المرحلة المتنقلة A.التالي ، قم بإجراء التحليل الطيفي الكتلي عن طريق اختيار مسح كامل بين mz 70 إلى 1 ، 000 دالتون.
والقرار في 70،000. حدد هدف AGC من واحد في 10 إلى السادس ، ووقت حقن أقصى يبلغ 20 مللي ثانية. بعد ذلك ، اضبط وقت التشغيل على 16.5 دقيقة.
قطبية تعيين إلى إيجابية. تم تعيين هدف AGC على واحد أس خمسة. الحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات مضبوط على 20 مللي ثانية.
ونطاق المسح الضوئي مضبوط على 70 إلى 1،000 نسبة الكتلة إلى الشحن. ثم اضبط جهد الرش على 3.0 كيلوفولت. والشعيرات الدموية الساخنة عند 275 درجة سلزية.
حدد تدفق غاز الغلاف عند 40 وحدة ، وتدفق الغاز الإضافي عند 15 وحدة ، وتدفق غاز الاجتياح عند وحدة واحدة. لتتبع نظائر الجلوتامين 13C5 ، بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 75٪ ، قم بتغيير الوسط إلى اثنين من الوسط المحتوي على الجلوتامين 13C5 مليمول ، واحتضانه لتحقيق حالة ثابتة من وضع العلامات على الخلايا محل الاهتمام. عزل وتحليل المستقلبات كما هو موضح سابقا.
بعد عزل وتحليل المستقلبات ، قم بتحليل نشاط نازعة هيدروجين السكسينات أو SDH عن طريق حساب النسبة المئوية لوضع العلامات على 13C3 fumarate و 13C4 fumarate و 13C3 succinate و 13C4 succinate. ثم قم بتقييم أكسدة السكسينات وتقليل الفومارات باستخدام الصيغة. في الظروف المعالجة بالمركبات ، فضل مجمع SDH النشاط الأمامي ، وكان دمج 13C4 succinate في 13C4 fumarate أعلى من 13C3 fumarate في 13C3 succinate.
في خلايا الساركوما العظمية المعالجة بمضادات الميسين ، فضل مركب SDH النشاط العكسي ، وكان دمج 13C3 fumarate في سكسينات 13C3 أكثر أهمية من 13C4 succinate في 13C4 fumarate.
