قم بتشغيل جميع مكونات إعداد الاستحواذ لقياس الفلورومتري. ضع الطبق السفلي الزجاجي 35 ملم الذي يحتوي على ألياف العضلات المنفصلة على مرحلة المجهر. قم بإزالة وسائط الثقافة بعناية باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر ، واستبدلها ب 2 ملليلتر من محلول جرس درجة حرارة الغرفة.
باستخدام مناور ميكانيكي أو آلي ، ضع السلكين البلاتينيين بشكل عمودي على قاع الطبق. تأكد من محاذاة أطراف القطب بالنسبة للمحور الطولي للألياف ، وعلى بعد بضعة ملليمترات من نهايات الألياف. اضبط موضع القطب عن طريق تدوير الطبق أو تحريك كل قطب كهربائي إذا تم تركيبه على مناور دقيق مستقل.
قم بتشغيل الضوء المرسل وابحث عن الألياف في مجال الرؤية باستخدام هدف 20 X. انقل مكعب مرشح EGFP إلى مسار الضوء. بعد إيقاف تشغيل الضوء المرسل ، قم بتنشيط ضوء الإثارة 488 نانومتر باستخدام مصراع ضوء يتم التحكم فيه عن بعد.
لتحديد الألياف الإيجابية EGFP ، قم بتوسيط الألياف بألمع إشارة EGFP في منتصف مجال الرؤية. استخدم الحجاب الحاجز الموجود في مسار ضوء الإثارة لتركيز ضوء الإثارة في منطقة معينة من الألياف. يتيح ذلك الحصول على الإشارة ، حيث تكون إشارة EGFP CaV1.1 هي الحد الأقصى.
اضبط موضع الألياف مع المرحلة الميكانيكية لتتماشى مع مسار ضوء الحجاب الحاجز ، وقم بتخزين موقع الألياف XY. بعد العودة إلى أول توطين محفوظ ، اضبط مدة نبضتين متتابعتين للتحفيز على 1 مللي ثانية ، والسعة إلى 20 فولت ، وقطبية النبضات على التناوب. بعد ذلك ، استخدم مفتاح تشغيل يدوي لتوصيل النبضين المتسلسلين.
أثناء التحفيز ، لاحظ انقباضات ألياف متجانسة متحدة المركز استجابة لنبضتين من القطبية المعاكسة. إذا لم يلاحظ أي انكماش أو انقباض متحد المركز واحد فقط مع نبضات قطبية متناوبة ، فتجاهل الألياف من بقية التجربة. أضف 2 ميكرولتر من محلول MTS 5 TAMRA 10 ملليمولار مباشرة إلى الطبق ، واخلطه برفق مع ماصة 1000 ميكرولتر.
احتضان لمدة أربع إلى خمس دقائق للسماح بانتشار جزيء الثيول الفلوري في تجويف نظام الأنيبيب المستعرض. من خلال التحفيز الميداني ، قم بتطبيق التحفيز المتكرر ثنائي القطب لاستحضار قطارات جهد العمل المتتالية بمعدل 50 هرتز لمدة 300 مللي ثانية كل 1 ثانية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة محلول التلوين من الطبق باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر.
واستبدله ب 2 ملليلتر من محلول جرس درجة حرارة الغرفة. دع الألياف الملطخة تتعافى من بروتوكول التلوين لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد إعادة تقييم صحة الألياف والنشاط الكهربائي بنبضتين متناوبتين ، انقل مكعب مرشح MTS 5 TAMRA إلى مسار الضوء ، وقم بتنشيط ضوء الإثارة 533 نانومتر باستخدام مصراع ضوء يتم التحكم فيه عن بعد لتأكيد تلطيخ الألياف بصريا.
بعد ذلك ، باستخدام الموقع المخزن على المسرح الميكانيكي ، ضع الألياف في منتصف الحقل باستخدام مكعب مرشح MTS 5 TAMRA ، والحجاب الحاجز ، وهدف غمر الزيت 60X. بعد إعادة توجيه أسلاك البلاتين لتحفيز المجال في كل طرف من طرفي الألياف ، قم بمحاذاة الأسلاك على المحور الرئيسي للألياف في خط مستقيم ، وباعد بينها خمسة ملليمترات ، مع وجود الألياف في المركز. في برنامج الاستحواذ ، حدد البروتوكول الذي سيتم استخدامه للاستحواذ.
يتم التحكم في هذه الخطوة فقط باستخدام الكمبيوتر ، وتقوم بتشغيل جميع الأجهزة النهائية للتحفيز الكهربائي والتحكم في مصراع مسار الضوء. بالنسبة لكل بروتوكول ، قلل من إجمالي وقت الاستحواذ قدر الإمكان لتجنب تبييض الإشارة ، ولكن اترك بضع عشرات من المللي ثانية من إضاءة الضوء واكتساب الإشارة قبل التحفيز الكهربائي الأول لتسجيل خط الأساس. قم بتشغيل البروتوكول بالضغط على تنفيذ.
يتم عرض الإشارة المسجلة تلقائيا على الشاشة. غالبا ما تخفي السعة الصغيرة للإشارة والانكماش الميكانيكي السريع للألياف معظم الإشارة ، وتعرض قطعة أثرية للحركة. أضف 1 ميكرومولار من 100 مليمولار وبنزويل بارا تولوين سلفوناميد إلى محلول التسجيل لتقليل الاستجابات التعاقدية ، وتمييز الإشارة الناشئة عن حركات S4 بسبب تنشيط الألياف.
بعد بضع دقائق ، قم بتشغيل نفس البروتوكول مرة ثانية. تمت إزالة قطعة أثرية الحركة الآن ، ولكن لا يزال هناك تغيير مضان صغير يتوافق مع حركة S4. حرك الطبق قليلا باستخدام المرحلة الميكانيكية للحصول على إشارة من منطقة خالية من أي ألياف أو حطام.
قم بتشغيل البروتوكول مرة أخيرة لتسجيل مضان الخلفية. قم بتصدير عمليات التتبع واستخدم برنامج جدول بيانات للتعبير عن الإشارة ك delta f على f 0 كدالة للوقت ، وتطبيق تصحيح خط الأساس إذا لزم الأمر. يتم عرض أمثلة الصور المنقولة والفلورية للعضلات المشرحة وغير المنفصلة التي تعبر عن بنية EGFP CaV1.1 هنا.
يوضح هذا الشكل الصور التمثيلية للألياف العضلية التي تعبر عن بنية EGFP CaV1.1 VS D3 قبل وبعد تلطيخ MTS 5 TAMRA. هذه الصبغة تلطخ أيضا السيستين الداخلي المنشأ للألياف غير المنقولة. تظهر الصور متحدة البؤر لبنية EGFP CaV1.1 VS D3 وتلطيخ MTS 5 TAMRA نمطا مزدوجا مميزا لتوطين CaV1.1 على نظام النبيب المستعرض للألياف العضلية.
يظهر هنا التسجيل الفلورومتري التمثيلي استجابة لاثنين من المثيرات ويقاس باستخدام الصمام الثنائي الضوئي. يتم تطبيع كلتا الإشارتين من خلال الحد الأدنى لقيمتهما ويتم رسمهما كدالة للوقت بالنسبة إلى إزالة الاستقطاب الخاصة بكل منهما. تظهر هذه التسجيلات أن مرحلة الارتفاع والوقت اللازم لذروة الإشارة متشابهان لكل من إزالة الاستقطاب المفروضة على الألياف.
