لبدء تحضير العينة ، قم بتشريح الورقة الحقيقية من عينة Arabidopsis thaliana المعدلة وراثيا المعالجة دوائيا باستخدام شفرة حلاقة حادة. ضع الورقة الحقيقية على شريحة زجاجية في قطرة ماء مع الجانب المحوري لأعلى. قم بتغطية الورقة الحقيقية ببطء بغطاء بدون فقاعات هواء.
للتصوير ، قم بإعداد مسار الحزمة عن طريق اختيار ليزر 514 نانومتر لبروتين الفلورسنت الأصفر ، أو إثارة YFP. احصل على جودة صورة عالية باستخدام طاقة ليزر عالية. قم بتشغيل PMT أو HYD وحدد عتبات نطاق الانبعاث العلوي والسفلي بناء على طيف فلوروفور YFP.
اضبط نافذة كشف من 530 إلى 570 نانومتر لجمع إشارة YFP. للحصول على الصورة المتسلسلة للون الثاني ، انقر فوق الزر "بحث" وأضف قناة جديدة. في البحث عن اثنين ، حدد ليزر 555 نانومتر لبروتين الفلورسنت الأحمر ، أو إثارة RFP ، وقم بتعيين نافذة كشف من 570 إلى 630 نانومتر لجمع إشارة RFP.
حدد عدسة أساسية 63X ، 1.2W على النظام لتصوير نشاط حركة مرور الغشاء تحت الخلوي داخل خلايا السلائف الثغورية. ابدأ التنسيق بحجم صورة 1024 × 1024 بكسل ، ثم قم بتحسينه بناء على عامل التكبير / التصغير والإعدادات الموضوعية للحصول على دقة جيدة. بعد ذلك ، قم بإعداد سرعة رأس المسح ، بدءا من سرعة 400 هرتز ، وقم بتحسين ذلك بناء على الحالة المحددة للعينات.
لتكبير منطقة الاهتمام دون تغيير العدسة الموضوعية ، أدخل عامل تكبير لواحد وقم بتحسينه بناء على الاحتياجات المحددة للتجربة. يشير متوسط الخط إلى عدد المرات التي سيتم فيها مسح كل سطر X للحصول على متوسط النتيجة. ابدأ بمتوسط خط 2X لتصوير أحداث الاتجار بالغشاء وتحسينها حسب الحاجة.
حدد وضع المسح الضوئي XYT في وضع الاكتساب لتمكين الأداة المساعدة للسلاسل الزمنية. بعد ذلك ، حدد فترة الانتظار بين النقاط الزمنية ضمن الفاصل الزمني. حدد عدد الإطارات التي سيتم جمعها بتحديد الإطارات.
استخدم وضع المسح الضوئي Z-stack مع أقصى إسقاط للكثافة لجمع المعلومات ثلاثية الأبعاد المتعلقة بحدث الاتجار بالغشاء داخل الخلية بأكملها. ثم حدد وضع المسح الضوئي XYZ في وضع الاستحواذ ومن ثم ستصبح الأداة المساعدة Z-stack قابلة للوصول. حدد الخيار Z عريض.
ضمن وضع المسح الضوئي، حدد الصور العلوية والسفلية لمكدس Z باستخدام زري البداية والنهاية. بعد ذلك ، حدد سمك الخطوة Z بالنقر فوق حجم الخطوة Z. لمعالجة الصورة ، انقر فوق علامة تبويب العملية الأساسية في برنامج متحد البؤر.
ضمن علامة تبويب المشاريع المفتوحة في أقصى الجانب الأيسر ، حدد ملف Z-stack المهتم. ثم ، في علامة التبويب الوسطى المسماة أدوات العملية ، حدد وظيفة الإسقاط. اختر الحد الأقصى في اللوحة المنسدلة للطريقة وانقر على زر التطبيق.
سيتم إنشاء صورة إسقاط Z-stack ضمن علامة التبويب المشاريع المفتوحة. لإنشاء الفيديو من صور السلاسل الزمنية ، انقر فوق علامة تبويب الملف في برنامج فيجي وافتح الوظيفة لفتح جميع صور السلاسل الزمنية واحدة تلو الأخرى بالترتيب الصحيح. بدلا من ذلك ، اسحب الصور إلى الصورة J لفتح البيانات بالترتيب الصحيح.
ثم ابحث عن وظيفة المكدس في علامة تبويب الصورة واختر الصور المراد تكديسها لإنشاء مقطع فيديو. بمجرد الانتهاء من ذلك ، احفظ الملف بتنسيق avi بمعدل الإطارات المطلوب. في الورقة الحقيقية للنباتات المعدلة وراثيا التي يبلغ عمرها سبعة أيام والتي تحمل مروج ERL1 ERL1 YFP ، تم تسليط الضوء على الخلايا المتناثرة بواسطة إشارة YFP حيث قام ERL1 YFP بتسمية غشاء البلازما.
كما لوحظت إشارات نقطية متعددة ، مما يشير إلى أن ERL1 كان موضعيا أيضا في الإندوسومات. سلط RFP Ara7 الضوء على إشارات مثقوبة متعددة في جميع الخلايا تقريبا ، مما يشير إلى الأجسام متعددة الحويصلات ، أو MVBs ، في هذه الخلايا. عندما اندمج RFP Ara7 مع إشارة ERL1 YFP ، تداخلت معظم الثقوب ، مما يشير إلى أنه تم نقل بعض جزيئات ERL1 YFP إلى MVBs.
أظهرت السلاسل الزمنية للأوراق الحقيقية التي تحمل بروتين علامة ERL1 YFP و MVB RFP Ara7 أن الإندوسومات التي تحمل علامة YFP انتقلت مع RFP Ara7 داخل خلايا سلالة الثغور. وأكدت أن ERL1 YFP كان موضعيا في الأجسام متعددة الحويصلات.
