Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

داخل خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية للفأر بالملقط المعقم. بمجرد إزالة PBS الزائد ، انقل المنديل إلى طبق بتري آخر واغسله مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما 10 ملليلتر من محلول PBS AA. أضف 20 ملليلترا من محلول كولاجيناز محضر إلى دورق بلوري يحتوي على منديل مجزأ بحجم سنتيمتر مربع واحد وقضيب مغناطيسي.

احتضان الدورق المختوم عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر. قم بتصفية التجانس من خلال فتحة 40 شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.38 ملم قم بالتصفية على طبق بتري وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر. تعليق بعناية جزء الأوعية الدموية اللحمية في 20 ملليلتر من DMEM الدافئة المكملة وأجهزة الطرد المركزي التعليق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 40 ملليلتر من وسط DMEM غير المكمل. تعليق الحنك في خمسة ملليلتر من DMEM المكملة. نقل التعليق إلى زجاجة T 25 سم مربع واحتضان.

اغسل الخلايا ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS AA الدافئ ومرتين باستخدام DMEM غير المكمل. لإزالة أي حطام خلوي وخلايا غير فأرة ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM الطازج الدافئ المكمل وقم بتغيير الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90 إلى 100٪ ، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين EDTA الدافئ إلى الخلايا المغسولة ب DEM.

احتضان لمدة خمس إلى سبع دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف أربعة ملليلتر من DMEM المكمل إلى الطبقة الأحادية للخلية المنفصلة وقم بتقسيم التعليق برفق. تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEM الدافئة.

بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، امزج الحبيبات برفق في ملليلتر واحد من DMEM المكملة. تلطيخ الخلايا مع تريبان الأزرق وعدها في غرفة نيوباور. خلايا البذور في قوارير T-75.

لضمان تكوين مستعمرة وانتشار عالية ، لاحظ مورفولوجيا الخلايا الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين تحت المجهر الضوئي. يكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين عن سيتوبلازم واسع النطاق مع إطالة ممدودة وخيوط دقيقة وفيرة داخل الخلايا.