Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

ابدأ بوضع الأنسجة في صفيحة زراعة الأنسجة المعقمة وإزالة الوسائط الزائدة. قم بقياس الأنسجة بمسطرة معدنية معقمة وصورها. أضف ثلاثة ملليلتر من وسائط DMEM / F-12 المتقدمة إلى الأنسجة المقطوعة وماصة الأنسجة لأعلى ولأسفل لغسلها.

ثم اغسل الأنسجة بثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. نضح الوسط من لوحة زراعة الأنسجة وقطعه إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات معقمة ومليلتر من وسائط الهضم. ثم اجمع الأنسجة في أنبوب سعة 50 ملليلترا يحتوي على خمسة ملليلتر إجمالا من وسط الهضم.

احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بخلط التعليق بشكل دوري عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. قم بتعطيل التربسين بإضافة خمسة ملليلتر من DMEM / F-12 المتقدم إلى الأنبوب.

ثم قم بتصفية العينة من خلال مصفاة مسام 70 ميكرومتر لإزالة أي حطام كبير. الآن ماصة 2 ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى أعلى المرشح ، واستخدم ماصة لجمع الحطام وبقايا الأنسجة لزراعة الخلايا الليفية. ثم لوحة الحطام لثقافة الخلايا الليفية.

أجهزة الطرد المركزي المرشح في درجة حرارة الغرفة في 200 إلى 300 غرام لمدة خمس دقائق ، ثم نضح الطاف. أضف خمسة ملليلتر من DMF 12 المتقدم إلى الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 300 جرام لمدة خمس دقائق. بالنسبة لتحلل خلايا الدم الحمراء ، أعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من محلول تحلل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر.

احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد طرد الخليط في نفس الظروف كما هو موضح سابقا ، قم بنضح المادة الطافية. إلى الحبيبات ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM / F-12 المتقدم ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند أربع درجات مئوية.

بعد استنشاق المادة الطافية ، أضف ملليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا المتاح تجاريا إلى الحبيبات واحتضانه لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي ونضح طاف الطافي مرة أخرى. ثم أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من DMEM / F-12 المتقدم.

قم بفصل كتل الخلايا عن طريق سحب التعليق عدة مرات باستخدام ماصة P1000. أجهزة الطرد المركزي التعليق وإزالة طاف. بعد ذلك ، احصل على أطراف ماصة P1000 و P200 مبردة مسبقا ، واستخدم الأطراف الباردة المثبتة على ماصة P1000 لإعادة تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة الغشاء ، قبل وضع الصقر على الجليد لمنع التصلب.

الحصول على لوحة مسخن من الحاضنة. باستخدام مجموعة ماصة P200 عند 48 ميكرولتر واستخدام أطراف باردة ، قم بإنشاء قباب مصفوفة غشاء القاع في اللوحة المسخنة مسبقا. ثم احتضانها لترسيخ مزيج الغشاء القاعدي.

بمجرد تصلب المصفوفة ، أضف ملليلتر إلى ملليلتر ونصف من DMEM / F-12 المتقدم ، مع استكماله بعوامل النمو والمثبطات. تم عزل الخلايا السرطانية وتم إنشاء عضويات الورم من الأنسجة الطازجة على مدى 15 يوما. في بعض الأحيان ، تمنع أحجام حطام الخلايا الكبيرة التصور الدقيق لعضويات الورم النامية.

لوحظ أن الكائنات العضوية النامية تختلف ظاهريا من الثقافات المعزولة أو المستديرة إلى الكروية أو الشبيهة بالمجموع ، اعتمادا على أصل الورم. قد تكون الثقافات العضوية ملوثة بالخلايا الليفية ، وهو منتج PI شائع لثقافة الخلايا السرطانية الأولية. بعد ما يقرب من سبعة أيام من المزرعة ، تهاجر الخلايا الليفية من قباب مصفوفة الغشاء القاعدي وتلتصق بألواح الخلايا ، مما قد يضر بالنمو العضوي الأمثل.

يتم إنشاء ثقافات الخلايا الليفية من حطام الأنسجة المستعاد من المرشح. تهاجر الخلايا من حطام الأنسجة وتلتصق بألواح الاستزراع.