للبدء ، أطفئ ضوء الغرفة. حدد عين أسفل لوحة العين في برنامج FlowView. قم بتغيير برج المكعب إلى أربعة TRITC ، وقم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في لوحة اللمس بالنقر فوق إيقاف التشغيل أسفل الإضاءة الخلفية لوحدة التحكم في لوحة اللمس في البرنامج.
ثم قم بإيقاف تشغيل شاشة الكمبيوتر. افتح الجانب الأمامي من غطاء القماش الأسود على المجهر. خذ الطبق ذو القاع الزجاجي 35 ملم الذي يحتوي على الأجنة من الصندوق الأسود وضعه على مرحلة المجهر.
ثم قم بتشغيل وحدة الإضاءة الفلورية ، واستخدم العدسة لتحديد الجنين محل الاهتمام. اجعله في بؤرة التركيز. أغلق غطاء القماش الأسود لحماية العينة من الضوء.
قم بتشغيل شاشة الكمبيوتر للوصول إلى البرنامج الذي يتحكم في المجهر. تغيير العين إلى LSM في البرنامج للحصول على الصور. إجراء الاجتثاث بالليزر في السيطرة على الأجنة غير المحفزة باستخدام هدف غمر الماء التكبير 25 مرة.
انقر فوق Bright Z ومدير التسلسل وتحفيز LSM من نافذة الأداة. قم بتعيين نوع الماسحة الضوئية على أنه Galvano ، وحجم المسح الضوئي على أنه 512 × 512. قم بتشغيل القناة الأولى والقناة الثالثة أسفل لوحة إعداد PMT للسماح باستخدام ليزر 1040 نانومتر ، وانقر فوق سرعة حية أربع مرات لتصور الجنين.
قم بتدوير الجنين باستخدام وظيفة الدوران لجعل المحور الخلفي الأمامي موجها رأسيا ، واضبط التكبير على ثلاثة. ارسم منطقة اهتمام أو عائد استثمار باستخدام أداة الشكل ضمن إعدادات المسح الضوئي، واضبط حجم عائد الاستثمار في اللوحة المرجعية. بعد ذلك ، اضبط عائد الاستثمار على 512 بكسل في العرض و 100 بكسل في الارتفاع.
لتعيين معلمات الاستحواذ لمكدس Z قبل الاجتثاث ، قم بتسجيل سطح الجنين على أنه صفر تحت القسم Z. اضبط البداية على أنها صفر والنهاية على أنها 100 ميكرومتر. اضبط حجم الخطوة على أنه ميكرومترين ، وقم بتنشيط وضع الاستحواذ Z عن طريق تحديد Z ضمن علامة التبويب السلسلة.
باستخدام وظيفة Z الساطعة ، اضبط شدة الليزر 1040 نانومتر لزيادة خطيا من 3٪ إلى 7٪ احفظ إعداد التصوير الحالي كمهمة أولى لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. لتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما قبل الاستئصال ، قم بتعيين عائد استثمار يبلغ 512 × 512 بكسل بالقرب من السطح البطني للجنين كما هو موضح سابقا. اضبط شدة الليزر 1،040 نانومتر على 3٪ تحقق من الوقت ، وقم بإلغاء تحديد Z أسفل لوحة السلسلة.
احتفظ بالفاصل الزمني كتشغيل مجاني ضمن لوحة الفاصل الزمني ، واضبط الدورة على 10. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. لتعيين معلمات الاجتثاث بالليزر ، حدد منطقة 3D مباشرة أسفل غشاء vitelline.
اضبط بداية مكدس Z كمستوى ، والنهاية على عمق 20 ميكرومتر. اضبط حجم الخطوة على 1.5 ميكرومتر. قم بتشغيل القناة الثانية والقناة الرابعة أسفل لوحة إعداد PMT للسماح باستخدام ليزر 920 نانومتر.
اضبط شدة الليزر على 30٪ واضبط الحصول على الصورة باستخدام الليزر لمكدس Z واحد داخل منطقة 3D المحددة. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. لتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما بعد الاجتثاث ، قم بتعيين الحصول على صورة لفيلم ما بعد الاجتثاث بمستوى Z واحد 100 إطار باستخدام ليزر 1 و 040 و 920 نانومتر.
اضبط شدة الليزر على 3٪ و 0.3٪ احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. حدد التسلسل تحت اكتساب. قم بتغيير مسار حفظ البيانات واسم الملف حسب الحاجة.
انقر فوق جاهز ، وانتظر حتى يقوم البرنامج بتهيئة خط الأنابيب ، ثم انقر فوق ابدأ لتنفيذ خط الأنابيب. لإجراء الاستئصال بالليزر في الأجنة المحفزة ، قم بتعيين معلمات الاستحواذ لمكدس Z قبل الاجتثاث كما هو موضح للأجنة غير المحفزة. احفظ الإعداد الحالي كمهمة أولى لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل.
لتعيين معلمات التحفيز البصري الوراثي ضمن عائد استثمار محدد ، قم بتغيير التكبير إلى واحد ، وحدد عائد استثمار يغطي السطح البطني للجنين. قم بإيقاف تشغيل القناة الأولى إلى كاشفات القناة الرابعة ، وانقر فوق تحفيز LSM ، وقم بإلغاء تحديد مستمر خلال المدة ، واكتب 12 ثانية. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية للخط التدفقي بالنقر فوق التحفيز في إدارة التسلسل.
حدد وقت انتظار مدته ثلاث دقائق بعد التحفيز لضمان التعطيل التام للميوسين وتفكيك F-actin القمي وتحقيق مورفولوجيا الأنسجة الثابتة قبل الاستئصال بالليزر. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما قبل الاستئصال بمستوى Z الفردي كما هو موضح للأجنة غير المحفزة ، باستثناء أن الليزر 1،040 و 920 نانومتر يستخدم للحصول على الصور. قم بتشغيل القناة الأولى إلى القناة الرابعة كاشفات.
اضبط شدة الليزر على 3٪ و 0.3٪ احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. تعيين معلمات للاستئصال بالليزر كما هو موضح للأجنة غير المحفزة. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل.
تعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما بعد الاستئصال بمستوى Z الفردي كما هو موضح للأجنة غير المحفزة. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في إدارة التسلسل. حدد التسلسل تحت اكتساب.
قم بتغيير مسار حفظ البيانات واسم الملف حسب الحاجة. انقر فوق جاهز وانتظر حتى يقوم البرنامج بتهيئة خط الأنابيب ، ثم انقر فوق ابدأ لتنفيذ خط الأنابيب. في الأجنة غير المحفزة التي تخضع للانقباض القمي ، أصبحت معكرونة الاسكواش mCherry غنية في المنطقة القمية الإنسية ، في حين أن CRY2Rho كان mCherry السلبي السائد هو الخلوي.
في الأجنة المحفزة ، أصبحت إشارة CRY2Rho السلبية المهيمنة mCherry غشاء البلازما المترجمة ، في حين اختفت الإشارة القمية الإنسية للاسكواش mCherry تماما. أدى الاستئصال بالليزر للأجنة غير المحفزة داخل مجال الانقباض إلى ارتداد سريع للأنسجة على طول المحور الخلفي الأمامي ، في حين أن الاستئصال بالليزر في الأجنة المحفزة لم يؤد إلى ارتداد ملحوظ للأنسجة. تم تحديد كمية الاجتثاث وعرضها هنا.
