للبدء ، خذ عينة الأنسجة السريرية المؤرشفة أو الطازجة المهضومة والموسعة واستمر في تلطيخ الأجسام المضادة عن طريق وضعها في بئر واحدة من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار. اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على حجم العينة ، أضف 0.5 إلى 2 ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت للتلطيخ لتغطية الجل بشكل كاف.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ثم اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. أضف الأجسام المضادة الثانوية المقابلة واحتضانها لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت للتلطيخ الذي تختاره.
أعد غسل العينة كما هو موضح سابقا ، وأضف 1 إلى 2 ملليلتر من البولي إيثيلين جلايكول على العينة في لوحة من ستة آبار. قم بتلطيخ العينة باستخدام إستر NHS المترافق من فلور 4 لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
بعد ذلك ، لإجراء تلطيخ الدهون ، خذ عينة الأنسجة الموسعة التي تم غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، ضع صبغة محبة للدهون تقليدية مخففة 200 مرة في 2 ملليلتر من 0.1٪ Triton X-100 أو PBS لمدة 72 إلى 96 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، واغسلها ثلاث مرات على الأقل باستخدام برنامج تلفزيوني. لأداء FISH ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتهجين من خلال الجمع بين 2 × SSC و 10٪ كبريتات ديكستران و 20٪ كربونات إيثيلين و 0.1٪ توين 20. ضع عينات الهلام المتجانسة في مخزن مؤقت للتهجين مسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، احتضان عينات الهلام بمخزن مؤقت للتهجين يحتوي على 10 مجسات بيكومولار FISH ضد الجين المستهدف طوال الليل عند 45 درجة مئوية. اغسل العينات بمحلول غسيل صارم مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما عند 45 درجة مئوية ومرتين لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق وتابع تصوير العينة أو تخزينها في PBS بالإضافة إلى 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
لتوسيع الأنسجة وتصويرها بالكامل ، انقل العينات الموسعة أربعة أضعاف في PBS إلى لوحة تصوير زجاجية ذات ستة آبار. إذا تم توسيع العينة أكثر ، فقم بتقطيعها إلى قطع أصغر. ضع 0.1٪ بوليسين على سطح الزجاج.
ضع العينة على الشريحة ، وقم بإزالة أي سائل زائد حول الجل بقطعة قماش ورقية معملية لمنع حركة الهلام أثناء التصوير. بعد ذلك ، قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر تقليدي واسع المجال أو مجهر متحد البؤر أو نظام تصوير آخر من اختيارك. بعد التصوير ، قم بتقليص العينات في PBS بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق على الأقل ، حيث يؤدي التخزين طويل الأجل في الماء منزوع الأيونات إلى تدهور إشارة الفلورسنت.
أخيرا ، قم بتخزين العينات في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية. سمحت الصور البؤرية لأنسجة دماغ الفأر الموسعة بالكامل بتصور البروتينات وهياكل غشاء الخلية والميتوكوندريا. كما تم تحديد الأحماض النووية لأنسجة العقدة الليمفاوية البشرية الرسمية والثابتة المضمنة في البارافين.
بعد توسع 3.5 أضعاف في قسم الكلى ، شوهدت الكبيبة الموسعة الخالية من الشقوق. ومع ذلك ، أدى عدم كفاية التثبيت أو التجانس إلى التصدع والتشوهات وفقدان الأهداف المصنفة في قسم آخر من الكلى.
