Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells

للبدء ، احتفظ بالخلايا في دورق ثقافة مساحته 75 سنتيمترا مربعا. نضح وسط الثقافة وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA لفصل خلايا الالتصاق.

احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسط. بعد ذلك ، اجمع الخلايا من القارورة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 480 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح الوسط.

أعد تعليق الخلايا في 5 إلى 10 ملليلتر من الوسط بناء على التقاء الثقافة الأصلي. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الخلايا وأضفها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر مع 100 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق. أضف الخلايا إلى مقياس الدم ، وعدها من خلال المراقبة تحت المجهر واستخدام عداد الإحصاء اليدوي.

خفف الخلايا إلى ثلاثة في 10 أس رابعة لكل ملليلتر في وسط الاستزراع بدون الفينول الأحمر. أضف 2.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار مع انزلاق غطاء مطلي بالبولي دي ليسين وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. قم بزراعة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة لتمكين ارتباط الخلية بانزلاق الغطاء.

في اليوم التالي ، افحص مرفق الخلية تحت المجهر المقلوب باستخدام هدف 20X. قم بإعداد محاليل مخزون المعالجة بالتركيزات المطلوبة وإنشاء عنصر تحكم للوسائط فقط ، وتحكم في السيارة فقط بتركيز يطابق مركب الاختبار ، وعنصر تحكم باستخدام FCCP الأيوني ومركبات الاختبار. العمل مع زلة غطاء واحدة في وقت واحد ، إضافة 1.8 ملليلتر من الوسط للحالة تحت الدراسة إلى الخلايا.

احتضان الخلايا المعالجة إما بمركب التحكم أو الاختبار عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في بيئة رطبة للوقت المطلوب. بعد فترة العلاج ، أضف 200 ميكرولتر من 10X TMRE إلى الخلايا. احتضان لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في بيئة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

قم بشفط الوسط برفق وشطف الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لتقليل تداخل الخلفية. ثم اقلب انزلاق الغطاء على شريحة مجهر تحمل علامة ظروف العلاج. تخيل الخلايا التي تعيش عند إثارة 549 نانومتر وانبعاث 575 نانومتر.

استخدم مجهرا متحد البؤر لالتقاط العديد من حقول Z-stack مع التقاط صور عالية السرعة قبل فقد سلامة الخلية. احفظ ملف الصورة وقم بتخزينه لتحليله لاحقا. احتفظت الخلايا ذات الميتوكوندريا النشطة بتلطيخ TMRE وأظهرت مضان عاليا.

لقد قللت الميتوكوندريا غير المستقطبة أو غير النشطة من إمكانات الغشاء ، وتفشل في الاحتفاظ ب TMRE ، وتظهر إشارة مضان منخفضة.