Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

قم بإعداد أنبوبين من الخرز الخزفي عن طريق ملء أنبوب PCR سعة 2 مليلتر بأنبوب سعة 200 ميكرولتر تقريبا مليء بخرز السيراميك 1.4 ملم وقم بتسمية الأنبوب وفقا لذلك قبل نقلهما داخل الغطاء المعقم. أضف الحجم الموصى به من المخزن المؤقت للتحلل الموجود في مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي إلى أنبوب PCR المسمى. احصل على مكعب يبلغ طوله ثلاثة ملليمترات تقريبا من عينة الدماغ المؤكدة بعدوى داء باستخدام قضيب خشبي وضعه في أنبوب مسمى مع معرف العينة و 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز في الأنبوب المسمى التحكم السلبي.

قم بتعطيل أنسجة المخ يدويا باستخدام عصا قضيب خشبية ثم دوامة بأقصى سرعة حتى يتم تحقيق التجانس الكامل للأنسجة. بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي المحللة المتجانسة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي صغير مسمى حديثا باستخدام ماصة واستخدمه لمزيد من خطوات استخراج الحمض النووي الريبي ، وإعداد CDNA ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

بعد إعداد CDNA وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تجمعات التمهيدي A و B ، قم بإجراء تنظيف PCR والقياس الكمي في منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. حبات Aliquot SPRI في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة من الزجاجة الرئيسية. يمكن أيضا إعدادها مسبقا.

قم بتخزين الأنابيب عند أربع درجات مئوية أو احتفظ بها في رف بارد أو ثلج. بعد ذلك ، قم بتسخين قسامة حبة SPRI عند حوالي 20 درجة مئوية ودوامة تماما لإعادة تعليق الخرزات في المحلول بأكمله. ثم في أنابيب 1.5 ملليلتر ، اجمع بين منتجات PCR التمهيدي تجمع A وتجمع التمهيدي B لكل عينة.

أضف الماء ليصل الحجم إلى 25 ميكرولتر إذا لزم الأمر قبل إضافة 25 ميكرولتر من حبات SPRI إلى كل منتج مدمج وخلطه. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع قلب أو تحريك الأنابيب من حين لآخر. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على رف مغناطيسي حتى يتم فصل الخرز والمحلول.

بمجرد الانتهاء من ذلك ، تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخرزة. ثم اغسلي مرتين لمدة 30 ثانية باستخدام 200 ميكرولتر طازجة من الإيثانول بنسبة 80٪ وتخلص من الإيثانول. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة جميع آثار الإيثانول باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر.

جفف الحبيبات في الهواء حتى يتبخر الإيثانول النزرة وتتغير الحبيبات من لامعة إلى غير لامعة. أعد تعليق الخرزات في 15 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز لاستعادة منتج الحمض النووي النظيف واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. افصل الخرزات عن المحلول على رف مغناطيسي.

بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، قم بإعداد تخفيف من واحد إلى 10 لكل عينة في ماء خال من النيوكلياز. قم بقياس تركيز الحمض النووي لكل عينة مخففة باستخدام مقياس فلوري حساس للغاية ومحدد ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.