للبدء ، قم بإذابة مخزون مجمد من خلايا SH-SY5Y بسرعة في FBS. تستكمل مع 10 ٪ DMSO وتمييع عشرة أضعاف مع وسائل الإعلام قبل تسخينها. ثم أجهزة الطرد المركزي الخلايا وإزالة طاف.
أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من الوسائط وخلايا البذور الدافئة مسبقا في قارورة T25. لتحضير زلات الغطاء المطلية ب PDL ، ضع 600 ميكرولتر من 50 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول PDL على كل بئر من زلات الغطاء المعقمة ذات الحجرة. يختلف حجم PDL المضاف إلى كل بئر بناء على حجم البئر.
احتضان زلات الغطاء ضبط درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول PDL وشطف الغطاء ثلاث مرات مع 1.8 ملليلتر من الماء المقطر. اترك الحجرة المطلية تجف في الهواء لمدة ساعتين.
بمجرد أن تصل خلايا SH-SY5Y إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، قم بفصلها عن طريق إضافة محلول التربسين. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة وسط DMEM تم تسخينه مسبقا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق بيليه في DMEM.
عد الخلايا على عداد خلايا تلقائي. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا بكثافة 1.5 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع على زجاج الغطاء الحجري المطلي ب PDL. في اليوم الأول واليوم الثالث ، استبدل الوسط ب DMEM المكمل إما بخمسة أو 2٪ FBS على التوالي ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، وإما 10 ميكرومولار RA أو 95٪ إيثانول من نفس الحجم الإضافي ليكون بمثابة التحكم في السيارة للتمايز.
قم بإعداد مخزون PKMO في DMEM الخالي من الفينيل الأحمر المسخن مسبقا والمكمل باثنين أو 10٪ FBS اعتمادا على حالة التمايز ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، و 20 مليمول من العنب. في اليوم السادس ، شطف الخلايا مرتين بوسائط التصوير واحتضان الخلايا بمحلول PKMO عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع وسائط التصوير قبل تسخينها.
للغسيل النهائي ، احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، استبدل الغسيل النهائي بوسائط تصوير جديدة تم تسخينها مسبقا تحتوي على 20 مليمول من العنب.
