للبدء ، أجهزة الطرد المركزي FBS بين عشية وضحاها في جهاز طرد مركزي فائق عند 110،000 جم وأربع درجات مئوية لإزالة sEVs الذاتية. تعقيم المادة الطافية عن طريق ترشيحها من خلال غشاء ترشيح فائق 0.2 ميكرون لإنتاج FBS خالية من sEVs. التالي في طبق استزراع 150 ملم ، طبق حوالي 3 مرات 10 إلى البلاعم السابعة المشتقة من نخاع العظام في 20 ملليلتر من وسط زراعة DMEM.
احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل قبل جمع sEVs من البلاعم. في اليوم التالي ، بعد التخلص من الوسط ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو برنامج تلفزيوني. استبدل الوسط ب DMEM الذي يحتوي على مصل بقري جنيني خال من 10٪ من sEVs قبل احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بناء على متطلبات التجربة ، قم بجمع ونقل الخلايا الطافية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا. نقل النتيجة في طاف من كل أنبوب إلى أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر وتجاهل بيليه.
هذه المرة ، أجهزة الطرد المركزي طاف في 2000 G لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الميتة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة عالية السرعة وتخلص من الكريات. بجانب إزالة الحطام والحويصلات الدقيقة ، قم بطرد مركزي من المادة الطافية التي تم الحصول عليها عند 10،000 جم لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
نقل المادة الطافية الناتجة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة الجديدة عن طريق إضافة 35 ملليلتر في كل أنبوب والتخلص من الكريات. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الفائقة في جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح عند 110،000 G لمدة 70 دقيقة قبل التخلص من المادة الطافية. اغسل الحبيبات الخام المخصبة ب sEVs الناتجة بمليلتر واحد من PBS.
مرة أخرى ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الحبيبات المغسولة في أحد الأنابيب ، واخلطها عن طريق السحب المستمر. انقل ملليلتر واحد من معلق PBS الناتج إلى أنبوب آخر يحتوي على الحبيبة, وكرر نفس الشيء حتى يتم خلط جميع الكريات في الأنابيب عن طريق الماصة. نقل المليلتر الناتج من PBS الغنية ب sEVs إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد.
ثم الطرد المركزي الأنبوب الجديد في جهاز طرد مركزي منضدية عند 110،000 جم لمدة 70 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الحبيبات الخام المخصبة ب sEVs الناتجة مع 100 ميكرولتر من PBS. أضف 1.2 ملليلتر من محلول تحضير البروتين في أنبوب بروتين قياسي لإذابة 30 ملليغرام من BSA الموجود فيه.
تمييع محلول البروتين القياسي الناتج مع برنامج تلفزيوني لتقليل تركيزه من 25 إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر. أضف ثمانية أحجام مختلفة من محلول البروتين القياسي المخفف إلى آبار صفيحة 96 بئرا ، وارفع الحجم إلى 20 ميكرولترا في كل بئر باستخدام PBB. أضف 18 ميكرولترا من محلول تحلل HEPES إلى آبار العينات ، متبوعا بإضافة ميكرولتر من عينات sEVs.
بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول عمل BCA المعد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في كل بئر. اترك الطبق يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة.
حساب محتوى البروتين الكلي في sEVs باستخدام النتائج التي تم الحصول عليها. أظهرت صور المجهر الإلكتروني النافذ ل sEVs المعزولة مورفولوجيا نموذجية تشبه الكأس. أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن sEVs المعزولة كانت مركزة في الغالب عند 136 نانومتر.
أظهرت اللطخة الغربية أن sEVs المعزولة تم إثراؤها بشكل كبير من علامات sEVs ، بما في ذلك CD9 و beta-actin و TSG101. تم الكشف عن علامة الشبكة الإندوبلازمية GRP94 فقط في محللة الخلية بأكملها. أشارت النتائج إلى أن الطريقة المستخدمة أسفرت عن sEVs بمستوى عال من النقاء.
