ابدأ في عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية عن طريق الوصول إلى معطف بافي البشري ونقل سبعة ملليلتر إلى أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر. أضف ستة ملليلتر من محلول PBS لغسل أولي. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 1،100 G في جهاز طرد مركزي مع دوار متأرجح ، والفرامل في درجة حرارة الغرفة.
جمع تعليق الكريات البيض باستخدام ماصة المراعي ونقلها إلى أنبوب مخروطي معقم جديد 15 ملليلتر. أضف محلول PBS إلى تعليق الكريات البيض حتى يصل إلى 10 ملليلتر واخلطه برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول تدرج الكثافة عن طريق وضع ثلاثة ملليلترات من وسط تدرج الكثافة في أنبوب مخروطي معقم جديد 15 ملليلتر.
اسمح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. أضف ببطء خمسة ملليلتر من تعليق الكريات البيض المخفف على جدران الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة لإنشاء فصل تدرج الكثافة من خمسة إلى ثلاثة. تجنب إزعاج الوسيط.
انتقل إلى فصل التدرج عن طريق الطرد المركزي للتعليق الموجود في وسط تدرج الكثافة باستخدام جهاز طرد مركزي مع دوار متأرجح وإيقاف تشغيل الفرامل. بعد ذلك ، قم بنقل ما يصل إلى 25 ملليلترا من الطبقة الرقيقة من PBMCs بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر مملوء ب PBS باستخدام ماصة المراعي واخلطها جيدا لإزالة الخلايا المتبقية والحطام ، وأجهزة الطرد المركزي للعينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 600 جم باستخدام فرامل عادية. تخلص من المادة الطافية واملأ العينة إلى 10 ملليلتر باستخدام برنامج تلفزيوني.
خذ حصلة لحساب الخلايا. لإزالة الصفائح الدموية ، قم بطردها بفرامل عادية واقلب الأنبوب بعناية للتخلص من المادة الطافية. بالنسبة للعزل الإيجابي للخلية الوحيدة CD14 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ، أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت للميكروبيدات والخرز المغناطيسي المناعي CD14.
احتضان تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لإزالة الخرزات غير المنضمة ، أضف واحدا إلى ملليلتر من المخزن المؤقت للميكروبيدات لكل مرة 10 إلى الخلايا السابعة قبل الطرد المركزي للتعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 600 جم ، ثم اقلب الأنبوب بعناية للتخلص من المادة الطافية. تحضير عمود LS ووضعه على المغناطيس قبل الاستخدام.
اشطفه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للميكروبيدات وأعد تعليق حبيبات الخلية على الفور في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للميكروبيدات لكل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة. أضف تعليق الخلية إلى مدخل عمود LS واجمع جزء الخلية السالبة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر أسفل مخرج العمود. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للميكروبيد.
بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه على أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر. ماصة خمسة ملليلتر من الميكروبيدات عازلة في مدخل العمود. أدخل على الفور مكبس المحقنة المملوء بالخلايا المستهدفة في مدخل العمود وقم بتوزيع الخلايا الموجودة في العمود.
ثم أجهزة الطرد المركزي CD14 السلبية و CD14 كسور الخلايا الإيجابية وتجاهل طاف. لتمايز الوحيدات إلى خلايا شجيرية مشتقة من وحيدات بشرية ، قم بإعداد معلق خلية يحتوي على 1.3 في 10 أس ست خلايا لكل مليلتر عن طريق إضافة الحجم المناسب من وسط التمايز إلى الخلايا الموجبة CD14. أعد تعليق الوحيدات عن طريق السحب باستخدام ماصة المراعي.
بعد طلاء 1.3 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر معلق لكل بئر من صفيحة 24 بئر ، احتضان في حاضنة ثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير وسط الاستزراع واستكمله بالسيتوكينات الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لجمع الخلايا المتمايزة ، انقل تعليق الخلية بالكامل إلى أنبوب مخروطي معقم باستخدام ماصة صغيرة واغسل قارورة الثقافة مرتين باستخدام PBS.
بعد الطرد المركزي للأنابيب المخروطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 180 جم ، أعد تعليق الحبيبات في الوسائط المناسبة أو المخزن المؤقت للإعداد التجريبي. أثناء تمايز الوحيدات ، قام تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم الإنترلوكين الأربعة والمحببات بتغيير النمط الظاهري للخلية. أظهرت البيانات أن الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية فقدت التعبير عن علامة السطح CD14 ، والتي يتم التعبير عنها بشكل أساسي بواسطة الخلايا الوحيدة واكتسبت تعبيرا كبيرا عن CD1A.
علامة تعبر عنها الخلايا المتغصنة البشرية. تحصل الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية أيضا على تعبير أعلى عن MHC2 HLA-DR ، وهو جزيء مقدم للمستضد تعبر عنه الخلايا المتغصنة البشرية والخلايا الأخرى التي تقدم المستضد.
