للبدء ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء والكاميرا ونظام الشفط. لغسل نظام التروية ، استخدم محلول رينغر في الغرفة الأولى ومحلول الزنك رينغر المكمل بالبيريثيون في الغرفة الثانية. بعد إغلاق الصنبور ، املأ الغرف بنفس الحلول.
لبدء تحضير العينة ، ضع غرفة التروية بحيث يكون الجانب الضيق من الأخدود متجها لأعلى وقم بتطبيق سيليكون مانع للتسرب حول الأخدود. ثم ، باستخدام ملقط ناعم ، انقل غطاء 13 ملم من محلول الغسيل أعلى الأخدود مع توجيه الخلايا لأسفل. ضع غطاء مقاس 22 مم فوق غطاء الغطاء مقاس 13 مم وشده باستخدام الملقط ، مع الحرص على عدم تكسير زلات الغطاء.
اقلب الحجرة واضغط عليها لتحرير السوائل. بعد ذلك ، املأ الأخدود ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل Ringer واضغط مرة أخرى ، لضمان عدم حدوث تسرب. قم بتركيب وتأمين غرفة التروية على المنصة.
ثم قم بتوصيل أنابيب التروية والشفط للتروية فوق الخلايا الموجودة في الأخدود. قم بتغيير معدل التروية إلى ما يقرب من مليلتر في الدقيقة وقم بتشغيل تروية محلول رينغر. للقياسات، افتح برنامج التصوير.
اضبط تكبير المجهر على 10X باستخدام الزر الأيسر للمجهر. بعد اختيار Live View ، استخدم عصا التحكم لتحريك النظام الأساسي والتركيز على الخلايا الموجودة في الأخدود. حدد الطول الموجي المناسب ل mCherry.
بمجرد تركيز الخلايا ، انقل النظام الأساسي لاختيار بقع الخلايا المناسبة. حدد القائمة المنسدلة رسم عائد الاستثمار. اختر رسم عائد استثمار دائري ورسم عائد استثمار على مجموعات الخلايا باستخدام الخلايا المعبرة عن mCherry.
قم بإنشاء عائد استثمار جديد يتجاوز الأول عن طريق الضغط باستمرار على زر Shift ثم بالضغط على عائد الاستثمار الحالي وسحبه. حدد رسم عائد استثمار في الخلفية المربعة من القائمة المنسدلة واضبط موقع وحجم عائد الاستثمار في الخلفية حيث لا توجد الخلايا. بعد التأكد من عدم وجود خلايا في عائد الاستثمار في الخلفية ، انتقل إلى علامة التبويب ND Acquisition.
حدد علامة التبويب الفرعية الطول الموجي وحدد خانة الاختيار الخاصة بها. تأكد من وضع علامة على خانة الاختيار الخاصة بالطول الموجي ل GFP أيضا. انقر فوق علامة التبويب الفرعية الوقت وحدد الفاصل الزمني للقياس كل خمس ثوان والمدة على أنها 30 دقيقة.
في لوحة المجهر ، اضغط على زر التشغيل لتمكين نظام التركيز المثالي أو PFS. بموجب الاستحواذ على ND ، تأكد من وضع علامة على PFS. اضبط التركيز وانقر فوق تشغيل الآن.
ابدأ قياس فترة خط الأساس لمدة 90 ثانية باستخدام نضح محلول رينغر. بعد 90 ثانية ، قم بالتبديل من نضح محلول Ringer إلى نضح محلول الزنك في Ringer ، وانقر فوق العلم الأحمر في أسفل يمين لوحة الواجهة الرئيسية بمجرد أن يبدأ ارتفاع التألق في التشبع. قم بالتغيير مرة أخرى إلى التروية باستخدام محلول Ringer حتى انتهاء وقت التجربة.
لتصدير البيانات باستخدام الطرح الأساسي، اضغط على زر تصحيح الخلفية واعرض التغييرات في نافذة اكتساب ND. انقر على تصدير زر لحفظ البيانات في الموقع المطلوب. نتجت الزيادة في التألق عن زيادة تركيز الزنك داخل الخلايا ، بينما أشار الانخفاض إلى نشاط ZnT-1 الذي ينقل الزنك عبر غشاء الخلية.
كان للنوع البري ZnT-1 منحنى مضان أكثر سلاسة من الطافر ، فيما يتعلق بالتباين في الاستجابات الخلوية لحمل الزنك. أظهر مخطط صندوقي يقارن أنشطة النوع البري والدلتا USCTD متوسط معدلات نقل مماثلة ، مما يشير إلى عدم وجود فرق بين النوع البري والطافر. ومع ذلك ، قد يشير الاختلاف في السبريد إلى اختلاف وظيفي.
