للبدء ، قم بإعداد 10 إلى 20 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة لعزل الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ). نقل حصص من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز سعة 1.5 ملليلتر. احتضن الأنبوب في كتلة حرارية عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم ضعه على الثلج لمدة دقيقتين.
بعد إعادة تعليق حبات oligo (dT) ، انقل الحجم المطلوب من تعليق الخرزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وضعه على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق حتى تشكل الحبيبات المغناطيسية حبيبة. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للتحلل. أعد تعليق الخرز.
ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. بالنسبة للجولة الأولى من التنقية ، أضف محلول التحلل إلى أنبوب عينة الحمض النووي الريبي واخلطه جيدا. ثم انقل الخليط إلى حبات oligo (dT) وأعد تعليق السحب بالكامل 10 مرات على الأقل.
اسمح للعينات بالاحتضان بالدوران المستمر في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، ضع العينة على مغناطيس لمدة خمس دقائق أو حتى يصبح العنصر الطافي صافيا. تخلص من المادة الطافية.
أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى الخرز واخلطه بعناية لإعادة الاستحمام. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى الخرز واخلطه بعناية لإعادة الاستحمام. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة خمس دقائق أو حتى يصبح العنصر الطافي واضحا.
تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من 10 ملليمولار تريس هيدروكلورايد البارد إلى أنبوب العينة واحتضانه عند 70 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، انقل الأنبوب بسرعة على المغناطيس.
وعندما يكون التعليق واضحا ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (A) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. للجولة الثانية من التنقية ، أضف 120 ميكرولترا من محلول التحلل إلى عينة الحمض النووي الريبي المستخلصة واخلطها جيدا. اغسل الخرزات المستخدمة في الجولة الأولى من التنقية بحجم متساو من المخزن المؤقت للتحلل.
ماصة 10 مرات لإعادة تعليق الخرز ثم وضع الأنبوب على المغناطيس لمدة خمس دقائق قبل التخلص من المادة الطافية. انقل خليط محلول تحلل الحمض النووي الريبي إلى الخرزات المغسولة واخلطه جيدا عن طريق الماصة. بعد غسل الخرزات كما هو موضح سابقا ، أضف 25 ميكرولترا من 10 مليمول تريس هيدروكلورايد البارد إلى أنبوب العينة واحتضانها عند 70 درجة مئوية.
بعد خمس دقائق ، انقل الأنبوب بسرعة إلى المغناطيس ، وعندما يكون التعليق واضحا ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، لتحويل ثنائي الكبريتيت ، انقل 19 ميكرولترا من عينة الحمض النووي الريبي المنقى من البولي (أ) المخصب إلى أنبوب ثمانية شرائط 0.2 ملليلتر وأضف ميكرولترا واحدا من التحكم في الارتفاع بنسبة كمية محددة مسبقا من واحد إلى 10،000. بعد إضافة 130 ميكرولتر من كاشف التحويل إلى الأنابيب والخلط الجيد ، ضع الأنبوب في جهاز PCR وابدأ برنامج PCR.
بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع العمود على أنبوب التجميع وأضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي إلى العمود. ثم انقل 150 ميكرولترا من العينة المعالجة بثنائي الكبريتيت إلى العمود والماصة جيدا. أضف 400 ميكرولتر من 95 إلى 100٪ إيثانول إلى العمود ، وأغلق الغطاء بسرعة واعكسه عدة مرات.
بعد الطرد المركزي المتكرر والغسيل والتحييد باستخدام محلول إزالة الكبريت ، انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 20 إلى 30 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز إلى العمود واتركه يقف لمدة دقيقة واحدة. أجهزة الطرد المركزي عند 10،000 G لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية ونقل 2.2 ميكرولتر من المواد الطافية إلى ثمانية أنابيب شريطية لتقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي.
تم تقييم كفاءة إثراء Poly (A) RNA بواسطة مقايسة الحمض النووي الريبي الكلي للرحلان الكهربائي الشعري ، مما أدى إلى انخفاض تلوث الريبوسوم بالحمض النووي الريبي بعد التنقية المزدوجة في خطوط خلايا سرطان البنكرياس. تم تقييم كمية الحمض النووي الريبي قبل وبعد العلاج ثنائي الكبريتيت عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري. بعد معالجة ثنائي الكبريتيت ، أظهر توزيع حجم الحمض النووي الريبي ذروة 200 إلى 500 نيوكليوتيد بسبب التجزئة الناجمة عن تفاعل ثنائي الكبريتيت.
أظهر الرحلان الكهربائي الشعري للأمتبليكون إعدادا ناجحا للمكتبة مع الحد الأدنى من التمهيدي المتبقي وعدم وجود ذروة تضخيم زائدة. بعد محاذاة قراءات التسلسل مع التسلسل المرجعي ، تم تعيين متوسط 2،440 من إجمالي القراءات إلى تسلسل الارتفاع ، وبلغ إجمالي معدل التحويل من C إلى T الذي تم تحليله متوسط 99.81٪
